Характеристика клинико-иммунологических и инфекционных факторов при бронхиальной астме у детей
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
0 мин, после чего надосадочную жидкость центрифугировали 20 мин при 1300 об/мин. Надосадочную жидкость концентрировали, затем диализовали 12 ч против дистилированной воды и 12 ч против среды Игла-МЭМ и использовали в различных тестах. В качестве контроля во всех исследованиях использовали надосадочную жидкость от лимфоцитов здоровых детей.
Для определения качественного состава цитокинов Т-лимфоцитов в культуральной жидкости использован метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле по В.И. Литвинову и соавт [132].
Принцип метода основан на электрофоретическом давлении высокомолекулярных соединений в столбиках полиакриламидного геля. Разделение медиаторов Т-лимфоцитов проводили в столбиках полиакриламидного геля, состоящих из концентрирующего и разделяющего слоев при токе 2-5 ма на столбик. Буферный раствор - триалициновый рН - 8,3. Столбики окрашивали 1% раствором амидочерного в 7% растворе уксусной кислоты в течение 15 минут. Обескрашивание электрофоретическое, проводится в 1% растворе уксусной кислоты в течение 2 часов.
Количественный уровень цитокинов - фактора некроза опухоли-? (ФНО-?); интерлейкина-4 (ИЛ-4) и интерлейкин-1 бета (ИЛ-1b) в сыворотке крови здоровых и детей, больных БА, определяли методом ИФА с помощью стандартных иммуноферментных тест систем Протеиновый контур Санкт-Петербург (Россия) [71].
Уровень свидетелей ранней стадии эффекторного этапа апоптоза - фермента, преобразующего IL1b, Caspase-1/ICE (ICE-1L1b Converting Enzyme) и последующей его стадии белка Annexin V (Vac-a) определяли при помощи иммуноферментного энзим - связанного иммуносорбентного анализа (enzyme - linked immunosorbent assay - ELISA) с использованием коммерческих наборов Human Caspase - 1/ICE ELISA, Human Annexin V ELISA kit, производитель фирма Bender Med (Austria).
Для разработки экспериментальной модели БА использовали 60 подопытных морских свинок, в возрасте 4,5-5 месяцев и средней массы 350-400 г. как вид лабораторных животных, высокочувствительных к индукции аллергических и аутоиммунных реакций. Работа с животными проводилась в соответствии с Европейской конвенцией об использовании экспериментальных позвоночных животных в научных целях. Все животные находились в условиях содержания соответствующих международным нормам GLP. Данная возрастная группа животных соответствует возрасту детей 7,5-8 лет [255].
Для микробиологического исследования мокроты у детей, больных БА, в периоде обострения с различием контаминации мокроты микрофлорой верхних дыхательных путей и полости рта, использовали количественный метод [191].
Этиологическая значимость микроорганизмов в заболевании учитывалась при уровне микробного числа не менее 106 (для выявления патогенной микрофлоры) Международный стандарт требует выделения микроорганизмов из мокроты в количестве больше чем 106 в 1 мл. Из колоний готовили мазки, выделяли чистые культуры, идентифицировали, определяли чувствительность к антибактериальным препаратам.
Для определения сенсибилизации к микроорганизмам у детей, больных БА, использовали методику фотометрического определения антител в сыворотке крови с использованием в качестве антигенов лиофилизированные микроорганизмы, выделенные из мокроты у детей, больных БА, в периоде обострения, разработанную ГИСК им. Тарасевича (Москва) [81].
Для оценки уровня минимальной ингибирующей активности (МИК) исследуемых препаратов использован метод двукратных серийных разведений в соответствующей жидкой питательной среде, а для выявления минимальной бактерицидной концентрации (МБК) - высевы проводили на плотную питательную среду из пробирок с визуально отсутствующим микробным ростом [114, 121].
Для подтверждения бронхиальной обструкции и ее степени у исследуемых детей, больных БА, проводили исследования вентиляционной функции легких по показателям МВЛ, ЖЕЛ, ОФВ1 с помощью спирографа, входящего в медицинский диагностический комплекс Сфера-4 в периоде обострения БА и в периоде ремиссии, до и после проводимой разработанной сочетанной терапии.
Степень нарушения вентиляционной способности и обструкции бронхов оценивали по наиболее информативным параметрам: форсированной жизненной емкости легких (ФЖЕЛ), объема форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) и отношение ФЖЕЛ (ОФВ1) к фактической ЖЕЛ-тест Тиффно (ТТ) [186, 204].
Функциональная диагностика включала электрокардиографическое исследование (ЭКГ), которое осуществляли с помощью электрокардиографа входящего в медицинский комплекс Сфера-4. Запись ЭКГ проводилась в 12 общепринятых отведениях, характеризующих функцию автоматизма, возбудимости, проводимости, признаки гипертрофии миокарда, нарушения реполяризации миокарда желудочков.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета прикладных программ Excel 2000, Statistica-5 на персональном компьютере ЭВМ Sonica, с определением среднеарифметических величин (М), среднего отклонения от средней (m), среднего квадратичного отклонения (G). Достоверность отличий полученных результатов определяли с помощью t-критерия Стьюдента с уровнем значимости [88]. Проверку вариационных рядов на нормальность распределения выборки осуществляли на основе вычисления показателей ассиметрии и эксцесса [88].
Нами применена методика учета степени отклонения t-критерия Стьюдента, позволяющая использовать его значения для сопоставления влияния всех исследуемых факторов на патологический процесс, степени отклонения того или иного показателя от норматива и по отношению