Характеристика клинико-иммунологических и инфекционных факторов при бронхиальной астме у детей
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
ецифических сывороток против человеческих иммуноглобулинов G, A, M, а также - стандартной нормальной человеческой сыворотки. Учет реакции проводили через 24 часа для иммуноглобулинов A, G, а через 48 часов - для иммуноглобулинов М.
Определение общего сывороточного IgE - уровень общего IgE в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализатора с использованием тест-системы фирмы Labodia (Швейцария) [71].
Приготовление гипериммунных моноспецифических сывороток к антигенам трахеи, бронхов и легких. Антигенным материалом служили секционные образцы бронхолегочной системы, взятых у случайно погибших детей с I(О) группой крови, через 2-4 часа от момента гибели. В качестве тканевых антигенов использовали водно-солевые экстракты, полученные из ткани трахеи, бронхов и легких. Ткань трахеи, бронхов и легких после отделения, размельчают ножницами и промывают проточной водой в течение 24 часов, а затем несколько раз заливают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Объем ткани измеряют в стерильном мерном цилиндре и определяют уровнем жидкости. Отдельно ткань трахеи, бронхов и легких подвергают гомогенизации. К каждой её части добавляют 4 части изотонического раствора натрия хлорида. Полученные однородные смеси отстаивают при температуре 4С и центрифугируют при 5000 об/мин., в течение 45 минут. Надосадочная жидкость - водно-солевая вытяжка ткани - является антигеном. Каждая водно-солевая вытяжка антигенов трахеи, бронхов и легких содержит - 1,5-2% белка [199].
В качестве подопытных животных использовали 9 кроликов породы шиншилла, в возрасте 5,5 - 6 месяцев и средней массы 2750-2800 г. Данная возрастная группа животных соответствует возрасту детей 8,5-9 лет. Работа с животными проводилась в соответствии с Европейской конвенцией об использовании экспериментальных позвоночных животных в научных целях. Все животные находились в условиях содержания соответствующих международным нормам GLP [255].
Гипериммунизацию 3-х кроликов проводили водно-солевым антигеном трахеи, 3-х кроликов водно-солевым антигеном бронхов, 3-х кроликов водно-солевым антигеном легочной ткани, путем посхемного подкожного введения тканевых антигенов в следующих рассчитанных по белку дозах: 50 мкг - 100 мкг - 150 мкг - 200 мкг - 300 мкг. Интервал между инъекциями составлял 2-3 суток.
С целью определения титров преципитинов к белковым водно-солевым тканевым антигенам, полученным из ткани трахеи, бронхов и легких, использовали постановку реакции преципитации Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосова [199].
Для выявления антигенов мимикрии у микроорганизмов, выделенных из мокроты, у детей с различными формами БА, использовали постановку реакции агглютинации с органоспецифическими сыворотками Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосова [199].
Определение титра комплемента в сыворотке крови по Л.С. Резниковой [148].
Определение титра комплемента проводили по общепринятой методике с учетом 50% гемолиза, норматив у здоровых детей в возрасте от 3 до 15 лет соответствует 59,9+1,1 гем. ед. Компоненты комплемента С2 и С3 определяли методом радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини [71]. Погрешность определяли 0,02 мг/мл.
Определение циркулирующих иммунных комплексов по Haskova с соавт. [263]. Метод основан на селективной преципитации комплексов антиген-антитело в 3,75% растворе полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000, с последующим фотометрическим определением плотности преципитата. Количество иммунных комплексов выражали в условных единицах оптической плотности, полученных в результате спектрофотометрических измерений в кюветах размером 1x1 см при 450 нм на спектрофотометре сф-26, изменения мутности пробы сыворотки в присутствии 3,75% полиэтиленгликоля в сравнении с сывороткой в таком же разведении 0,1 мл боратным буфером без этого препарата. Величину экстракции для удобства умножали на 1000.
Для определения аутоантител в сыворотке крови к белковым водно-солевым антигенам бронхолегочной системы, полученным из клеточных структур слизистой бронхов от случайно погибших детей использовали реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА) по Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосова [199].
Липополисахаридные антигены из структур трахеи, бронхов, легочной ткани получали от случайно погибших детей по методу В.Д. Яковенко и соавт. [162].
Аллергический статус больных оценивали по показателям аутоаллергии с количественным использованием в качестве антигенов гистамина, серотонина, гиалуронидазы полученных в (Сорбент - ЛТД, Москва), липополисахаридных антигенов бронхолегочной системы, цитокинов сенсибилизированных Т-лимфоцитов с количественным вычислением показателя аутоантител в реакции фотометрического определения аутоантител по методу В.В. Квирикадзе с соавт. Разработанного ГИСК им. Тарасевича (Москва) [81].
Исследования клеточного звена иммунитета (CD19 - В-лимфоциты, CD3 - Тобщ.-лимфоциты, CD4 - Т-хелперы, CD8 - Т-супрессоры, CD95 - мононуклеары несущие на клеточной мембране один из маркеров апоптоза), проводили с помощью моноклональных антител, используя коммерческие наборы, полученные в иммунохимической компании (Сорбент - ЛТД Москва), в реакции непрямой поверхностной иммунофлюоресценции [132].
Методика определения цитокинов по В.И. Литвинову и соавт. [107]. Лимфоциты, выделенные из 5 мл венозной крови от здоровых и больных БА (интактные и сенсибилизированные) инкубировали в течение 24 часов при температуре 37С в среде 199 с бронхолегочными антигенами (0,03 г./л), затем осаждали центрифугированием при 3000 об/мин, в течение 1