Разработка технологии иммобилизации B-галктозидазы и оценка её биологического действия на молоко и некоторые молочные продукты
Дипломная работа - Разное
Другие дипломы по предмету Разное
ология также запрещена к использованию. Таким образом, в настоящее время единственным видом асбеста, используемым на мировом рынке, является хризотил. Производители применяют политику контролируемого ответственного использования хризотила, направленную на снижение риска негативного воздействия на здоровье людей, прежде всего рабочих, занятых на производстве.
Лавсан - химическое синтетическое полиэфирное волокно. По своему составу - сложный эфир терефталевой кислоты и этиленгликоля. Лавсан химически инертен, устойчив к действию щелочей, кислот, микроорганизмов; обладает высокой прочностью, упругостью, термостойкостью. Недостаток - менее гидрофилен, чем другие носители.
Крахмал и лавсан, как химические чистые носители, использовались в первоначальном состоянии без подготовки. Асбест, опилки силикагель подготавливают следующим образом. Силикагель был просеян, промыт водой, прокипячен 10 мин в воде. Асбест и опилки не кипятили. Затем носители промывают в 1Н растворе NaOH, заново промывают водой, потом промывают в 1Н HCl , снова водой и отмачивают 1 час в дистиллированной воде. Данную процедуру повторяют два раза, после этого носители хранят в закрытом сосуде в дистиллированной воде, покрывающей поверхность носителя. Такая процедура необходима для достижения максимального очищения адсорбционной поверхности носителя от органических и неорганических веществ.
Оценка активности иммобилизованного фермента. Выявление неэффективных носителей. Опыт иммобилизации в-галактозидазы на носителях с выдержкой носителя в 0,01 и 0,03% растворах фермента 1 сутки.
В колбах приготавливается по 100мл 0,01 и 0,03% растворы в-галактозидазы, затем вносилось по 10г асбеста, силикагеля, крахмала 10%-го, опилок и лавсана. После этого колбы оставляли при периодическом встряхивании на сутки. После данной процедуры носители с иммобилизованным ферментом промывались дистиллированной водой. В колбах приготавливался 100мл 5% раствора лактозы и вносились носители с иммобилизованной в-галактозидазой. Колбы помещали в термостат с температурой гидролиза 38СФC. Степень снижения концентрации лактозы определяли через 1,2 и 3 суток рефрактометрическим методом. Дальнейшее выдерживание невозможно из-за испарения раствора. На 10% геле крахмала не удалось иммобилизовать фермент. Эффективность действия фермента в 2-х концентрациях, иммобилизованного на других носителях, представлена в таблицах 2.12 и 2.13.
Таблица 2.12 Эффективность действия 0,01% в-галактозидазы на снижение концентрации лактозы (исходный раствор лактозы - 5%-й)
Опытная группаВремя измерения, сут123Контроль, 5% раствор лактозы5,020,144,970,214,950,12Нативный фермент %
Р3,610,17
,91
<0,053,560,13
,62
<0,053,530,05
,31
<0,001Фермент, иммобилизованный на носителях:лавсан %
Р3,560,04
,91
<0,0013,340,008
,20
<0,0013,120,037
,77
<0,001силикагель %
Р4,780,012
,21
<0,0014,710,13
,76
<0,014,660,21
,82
<0,01асбест %
Р3,200,14
,74
<0,053,010,042
,56
<0,0012,980,025
,95
<0,001опилки %
Р2,850,016
,77
<0,0012,730,18
,92
<0,012,580,546
,91
<0,05
% - процент падения лактозы относительно контроля;
Р - достоверность относительно контроля.
Таблица 2.13 Эффективность действия 0,03% в-галактозидазы на снижение концентрации лактозы (исходный раствор лактозы - 5%-й)
Опытная группаВремя измерения, сут123Контроль, 5% раствор лактозы5,020,144,970,214,950,12Нативный фермент %
Р2,990,008
,51
<0,0012,950,016
,30
<0,0012,950,021
,30
<0,001Фермент, иммобилизованный на носителях:лавсан %
Р2,810,012
,91
<0,0012,510,004
,50
<0,0012,420,025
,7748,90
<0,001силикагель %
Р4,670,01
,02
<0,0014,620,21
,90
<0,054,520,04
,30
<0,01асбест %
Р2,910,029
,90
<0,012,760,037
,50
<0,012,680,016
,10
<0,001опилки %
Р2,030,012
,40
<0,0011,820,042
,60
<0,0011,700,012
,30
<0,001
% - процент падения лактозы относительно контроля;
Р - достоверность относительно контроля.
Выводы. На эффективность действия были исследованы: нативная в-галактозидаза в концентрациях 0,01% и 0,03%, а также фермент, иммобилизованный на лавсане, силикагеле, асбесте и древесных опилках. При гидролизе нативным ферментом концентрация лактозы за 1 сутки резко снизилась (при 0,01% ферменте - на 29%, при 0,03% - на 40,5%), а затем изменялась незначительно, т.е. за сутки он практически инактивировался. При гидролизе иммобилизованная на лавсане, асбесте и опилках в-галактозидаза эффективно действовала даже на 3 сутки: при 0,01% ферменте концентрация по сравнению с контролем составила 37,2; 40,05 и 48%, а при 0,03% ферменте - 51,1; 46 и 65% соответственно на лавсане, асбесте и опилках. Фермент, иммобилизованный на силикагеле, не показал желаемого снижения концентрации лактозы. Оценка продолжительности действия иммобилизованного фермента на снижение концентрации лактозы. Следующим этапом исследования необходимо было выяснить продолжительность действия и срок хранения фермента.
Повторялась процедура иммобилизации фермента на лавсане, асбесте и опилках. 10г каждого носителя с ферментом вносили в 100мл 5% раствора лактозы. После выдерживания в термостате 1 сутки рефрактометрическим методом определяли снижение лактозы в растворе. После этого носитель извлекали из раствора, промывали дистиллированной водой и помещали на 1 сутки в холодильник при температуре 4СФC. Затем вынимали стаканчики с иммобилизованным на носителях ферментом, нагрева