Разработка технологии иммобилизации B-галктозидазы и оценка её биологического действия на молоко и некоторые молочные продукты
Дипломная работа - Разное
Другие дипломы по предмету Разное
?ципах, позволяющих закрепить структуру фермента таким образом, чтобы активный центр его молекулы сохранял свою работоспособность в течение длительного времени, не подвергаясь структурным изменениям, приводящим к нарушению его конфигурации.
Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании их в прикладных целях по сравнению с нативными предшественниками:
гетерогенный катализатор легко отделить от реакционный среды, что дает возможность:
а) остановить в нужный момент реакцию;
б) использовать катализатор повторно;
в) получать продукт, не загрязненный ферментом (это особенно важно в ряде пищевых и фармацевтических производств);
- использование гетерогенных катализаторов позволяет проводить ферментативный процесс непрерывно, например в проточных колонных, и регулировать скорость катализируемой реакции, а также выход продукции путем изменения скорости потока;
иммобилизация фермента способствует целенаправленному изменению свойств катализатора, в том числе его специфичности (особенно в отношении к макромолекулярным субстратам), зависимости каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, аго стабильности по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям;
иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность путем изменения свойств носителя под действием некоторых физических факторов (свет или звук).
Успех практического использования препаратов иммобилизованных ферментов значительной степени определяется подготовительным этапом работы - выбором подходящего носителя и метода иммобилизации, а также знанием кинетико-термодинамических особенностей катализа иммобилизованных ферментов.
Носители для иммобилизованных ферментов. Для получения иммобилизованных ферментов используется огромное число носителей, как органических, так и неорганических. Основные требования, предъявляемые к материалам, следующие:
высокая химическая и биологическая стойкость;
высокая механическая прочность;
достаточная проницаемость для ферментов и субстратов, большая удельная поверхность, высокая вместимость, пористость;
возможность получения в виде удобных в технологическом отношении форм (гранул, мембран, труб, листов и т.д.);
легкое переведение в реакционноспособную форму (активация);
высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность проведения реакции связывания фермента с носителем в водной среде;
невысокая стоимость.
Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. На основании этого все существующие методы физической иммобилизации (т.е. при которой фермент не соединен с носителем ковалентными связями) можно разделить на четыре группы:
. адсорбция на нерастворимых носителях;
. включение в поры геля;
. пространственное отделение фермента от остального объема реакционной среды с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);
. включение в двухфазную реакционную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.
Рисунок 1.3 Способы физической иммобилизации ферментов:
а) адсорбция на нерастворимых носителях; б) включение в поры геля; в) отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны; г) использование двухфазной реакционной среды.
Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях. Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех существующих сейчас способов иммобилизации ферментов. В настоящее время является наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных препаратов промышленного значения.
Носители для адсорбционной иммобилизации. Носители для адсорбционной иммобилизации можно разделить на два основных класса - неорганические (кремнезем, оксиды алюминия, титана, различные природные алюмосиликаты, пористое стекло, керамика, активированный уголь и пр.) и органические (различные полисахариды и полимерные ионообменные смолы, коллаген).
Обычно носители применяются в виде порошков, мелких шариков и гранул. Методика адсорбционной иммобилизации. Иммобилизация ферментов путем адсорбции на нерастворимых носителях достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося фермента препарат иммобилизованного биокатализатора готов к использованию. На практике применяются следующие методы:
Статический способ наиболее прост и состоит в том, что носитель вносят в водный раствор фермента и полученную смесь оставляют на некоторое время без перемешивания. Иммобилизация достигается за счет самопроизвольной диффузии фермента к поверхности носителя с последующей адсорбцией. Недостатком метода является то, что для получения препарата с высоким содержанием адсорбированного фермента и равномерного заполнения поверхности носителя последний приходится выдерживать в контакте с раствором фермента в течение длительного времени (несколько суток).
В лабораторной практике чаще всего применяется способ с перемешиванием, при котором носитель суспендируется в растворе фермента и полученная смесь непрерывно перемешивается с помощью магнитной мешалки или на лабораторной качалке. Этот способ гораздо эффективнее статического и обеспечивает более полное равномерное заполнение поверхности носите