Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
? E. Сoli
Трансформацию проводили кальциевым методом и методом электропорации.
Подготовка компетентных клеток для электротрансформации. Петлей с косяка засевали "ночную культуру" E.coli BL21(DE3)pLysS в пробирку с 5 мл LB-среды и инкубировали ночь на качалке при 37oС. В колбу со 100 мл LB-среды вносили 1 мл ночной культуры и растили при 37o с хорошей аэрацией до плотности 0.5-1 ОЕ при 590 нм. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 15 мин в предварительно охлажденных стаканах. Следующие операции проводили в ледяной бане. Осажденные клетки дважды промывали холодным раствором для промывки клеток (1 mM HEPES pH 7.0) и два раза 10%-ным глицерином. Ресуспендировали клетки в 200-300 мкл 10%-ного глицерина. Полученные компетентные клетки хранили при -70oС, расфасованными аликвотами по 70 мкл.
Электротрансформация. Электрокомпетентные клетки размораживали при комнатной температуре и помещали на лед. К суспензии клеток добавляли 1 мкл раствора ДНК (из лигазной реакции) , смесь выдерживали во льду более 1 мин. В предварительно охлажденные ячейки помещали 70 мкл суспензии и обрабатывали одиночным высоковольтным импульсом (1700 В). Сразу после обработки в ячейку добавляли 1 мл SOC-среды, клетки переносили в пробирки и инкубировали 1 час при 37oС для экспрессии генов антибиотик резистентности. После этого производили высев на чашки с LB-агаром, содержащим соответствующие антибиотиками. Клетки инкубировали ночь при 37oС.
Приготовление клеток кальциевым методом и трансформация
Подращивали культуру клеток до оптической плотности 0,3. Поместили клетки в большие пробирки "Эппендорф", центрифугировали 2 мин при 3000 об/мин. LB-среду слили, добавили 500 мкл 100 mM CaCl2. Центрифугировали в течение 2 мин при 3000 об/мин. К осадку добавили 100 мкл буфера К, клетки ресуспендировали, оставили на 30 мин при 0oС. Затем добавили ДНК ( 30 нг вектора из лигазной реакции). Оставили еще на 30 мин при 0oС, после чего перенесли клетки на 2 мин в баню на 42oС . Затем образцы опять перенесли в ледяную баню, инкубировали 5-7 мин. Добавили 500 мкл LB-среды, инкубировали 1 час при 37o С и хорошей аэрации.
На чашки с LB агаром, содержащим соответствующий антибиотик, высевали 300 мкл клеток. Инкубировали ночь при 37oС.
2.2.7 Анализ клонов
Анализ клонов проводили рестрикцией плазмидной ДНК или с помощью метода ПЦР с колоний.
Мини-препаративное получение плазмидной ДНК.
Клетки, содержащие плазмидную ДНК, выращивали в 2 мл LB-среды до поздней логарифмической фазы роста. Клетки центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин в центрифуге Eppendorf (Eppendorf, США). Клетки ресуспендировали в 100 мкл раствора 1 () содержащем РНКазуI (10 мкг/мл) и лизоцим (7мг/мл), инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Добавили 200 мкл раствора 2 (0,2 н NaOH, 1% SDS). Инкубировали 15 мин. Пробирки переносили в лед и добавляли 150 мкл 3 М ацетат Na. Оставили на льду на 15 мин, затем центрифугировали при 12000 об/мин. Супернатант переносили в пробирку и переосаждали этанолом. ДНК промывали 70% этанолом, сушили и растворяли в буфере ТЕ.
ПЦР с колоний.
Отдельные колонии ресуспендируются в 30 мкл ТЕ-буфера, образцы кипятятся 5 минут и центрифугируются 3 мин при 3000 об/мин. В супернатанте находится плазмидная ДНК. В отдельные пробы с15 мкл реакционной смеси для ПЦР добавляется по 5 мкл раствора плазмидной ДНК. Проводится ПЦР с использованием одного универсального праймера, комплементарного, например, Т7 терминатору вектора pET-21d (или pET-28b), и праймера, комплементарного 5/-концу фрагмента. Такой подход используется для избежания фальшивого позитивного результата при выполнении данной процедуры и заодно сразу подтверждается правильная ориентация фрагмента в векторе [47].
2.2.8 Клонирование ДНК-полимеразы фага Т4
Клонирование гена Т4 ДНК-полимеразы проводили в два этапа, так как сайт для эндонуклеазы XhoI находится внутри последовательности гена и в праймере к 3/-концу гена. Клонирование 5/-концевого фрагмента описано выше.
Анализ клонов проводился обработкой плазмидной ДНК рестриктазами XhoI и SphI. Отщепленный фрагмент свидетельствовал о присутствии клонированного N-конца гена Т4 ДНК-полимеразы (рис 5) в плазмидах четырех клонов.
Клонирование 3'-концевого фрагмента гена 43. Расщепляли полученную плазмиду, содержащую 5'-концевую последовательность гена рестриктазой XhoI. Проводили лигирование со вставкой аналогично предыдущей реакции лигирования.
Трансформировали клетки BL21(DE3), приготовленные кальциевым методом[13].
Анализ клонов проводили обработкой плазмидной ДНК рестриктазой XhoI. В качестве контроля служила ДНК рЕТ21-d с клонированным 5'-концом гена 43 (плазмида pET43N). Было отобрано 2 клона (2 и 9), в которых видна была вставка большого фрагмента. Для определения ориентации большего фрагмента гена 43 (3'-конца) производили гидролиз рестриктазами NsiI и BspLu11II (изошизомер эндонуклеазы XbaI). О результате расщепления судили по электрофорезу в 1%-ном агарозном геле. Полоса, соответствующая 2072 парам оснований, свидетельствовала о правильной ориентации лигированного фрагмента в обоих клонах (рис. 5).
2.2.9 Индукция экспрессии генов
Штрихом засеяли поверхность агара, клетки инкубировали 12 часов при 37o С. Затем засеяли культуру в 50 мл LB-среды и выращивали до плотности 0,5 ОЕ при 590 нм. Отобрали по 5 мл исходной культуры и к основной массе добавили индуктор - ИПТГ (водный раствор) до конечной концентрации 40мкг/мл. После этого клетки оставили расти при 37oС. Через 3 часа отобрали по 5 мл индуцированной культуры. По 1 мл всех образцов (исходные и индуцированн