Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
способен фосфорилировать 5/-OH концы как одноцепочечных молекул ДНК, так и концы или ники в двухцепочечных молекулах [25]. Ионы Mg2+, Mn2+, Co2+, Zn2+, Ni2+, Ca2+ поддерживают высокую активность фермента , в то время как ионы Cu2+ являются ингибиторами. Обычным субстратом для измерения активности этой киназы является одноцепочечная ДНК длиной 100-200 п. о.[25].
Функция полинуклеотидкиназы в клетках млекопитающих остается неясной. Возможно, она играет особенную роль в репарации поврежденной ДНК в кооперации с полинуклеотид лигазой [24].
Использование полинуклеотидкиназы фага Т4
1) Киназная и фосфатазная активности фермента при желании могут быть использованы независимо. При инкубации в отсутствии АТФ 3/-фосфат можно убрать с ДНК или РНК без разрушения 5/-фосфата. Если олигонуклеотид с 3/-фосфатом инкубировать в присутствии фермента и АТФ при рН 9,0 (или выше) ограниченное время, то 5/-фосфат может быть введен не затрагивая основной массы 3/-фосфатов [22].
) 5/-концевой гидроксил полинуклеотида может быть мечен как с помощью прямой реакции, так и с помощью реакции обмена, которую фермент катализирует в присутствии [?-32P]АТФ и АДФ [26]:
5/-ОН-конец + АТФ - 5/-Фосфат-конец + АДФ
Таким образом можно использовать обратную реакцию для прямого мечения 5/-фосфорилированных концов двухцепочечных нуклеиновых кислот избегая предварительного дефосфорилирования [27].
Киназную реакцию можно ускорить (улучшить) добавлением ПЭГ, что может обеспечить более эффективную реакцию при очень низких концентрациях субстрата [26].
) Разработан быстрый и количественный метод измерения активности эндонуклеаз рестрикции второго класса. Он позволяет количественно определить число сайтов разрезания эндонуклеазой на молекуле ДНК. Число образуемых фрагментов в молях может быть определено по количеству включенной в нуклеотидную цепь радиоактивности, т. к. величина введенной метки 32Р пропорциональна числу образующихся концов ДНК и не зависит от количества нуклеотидов в ней [28, 29].
1.6 РНК-лигаза фага Т4
Т4 РНК-лигаза была открыта в 1972 году в лаборатории of Hurwitz. Фермент был обнаружен как активность, катализирующая циклизацию гомополирибонуклеотидов с 3/-концевым гидроксилом и 5/-концевым фосфатом с образованием 3/-5/ фосфодиэфирной связи [30]. РНК-лигаза (ЕС 6.5.1.3) продуцируется клетками E. coli, зараженными фагом Т4. Фермент катализирует АТФ-зависимое внутри- и межмолекулярное образование фосфодиэфирной связи между 5/-фосфат и 3/-гидроксильным концами РНК. Реакция сопровождается гидролизом АТФ до АМФ и пирофосфата. [31,32,33]. Фермент может осуществлять межмолекулярную реакцию как с РНК, так и с ДНК. В 1977 году было показано, что РНК-лигаза является продуктом гена 63 (gp63) фага Т4 и что этот же фермент осуществляет присоединение хвостового отростка к базальной пластине фага [31,34].
Физические свойства РНК-лигазы
Молекулярная масса фермента по данным SDS-электрофореза колеблется от 41 до 45 кДа. В неденатурирующих условиях масса составляет 47 кДа по результатам гель фильтрации и 48,2 кДа по данным седиментационного ультрацентрифугирования.
Изоэлектрическая точка для фермента 6,1. Поглощение раствора белка при концентрации 1 мг/мл и длине волны 280 нм составляет 1,3 [31].
Реакции, осуществляемые РНК-лигазой.
- Е + АТФ Е-рА + РРi
- Е-рА + рNn Е [A5/ pp5/ Nn]
- Е [A5/ pp5/ Nn] + Mm MmpNn + AMФ + Е
А. Прямая межмолекулярная реакция.
Рисунок 3 Показывает механизм прямой межмолекулярной реакции. Олигорибонкулеотид А3 с 3/-ОН концом (называемый акцептором) присоединяется к 5/-фосфорилированному донору рСр. Изучение субстратной специфичности фермента позволило сделать вывод, что в РНК-лигазе содержится как минимум 3 сайта, связывающих нуклеотиды. Первый сайт связывает АТФ, второй связывает акцептор, содержащий реактивный 3/-гидроксил и третий связывает донор, несущий 5/-фосфат для связывания с акцептором.
Cубстрат-связывающие сайты фермента имеют разную специфичность.
Донорный сайт связывает остаток нуклеозида и его две ассоциированных фосфатных группы с наименьшей специфичностью к нуклеозиду.
Акцепторный сайт связывает 3 нуклеозида и 2 фосфата. При этом выявляется сильное предпочтение к рибонуклеозидам, в сравнении с дезоксирибонуклеозидами.
АТФ-связывающий сайт высоко специфичен относительно аденозиновой части молекулы АТФ[31].
- Аденилирование фермента с АТФ с освобождением пирофосфата- первое событие, происходящее в процессе образования фосфодиэфирной связи. Эта реакция может происходить в отсутствии донора и акцептора. Аденилированный фермент может освобождаться в присутствии пирофосфата с восстановлением АТФ. Аденилированный фермент можно отделить от свободного с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS [31,34]. Один моль АТФ связывается с одним моль фермента.
2)Образование аденилированного донора. Адениловая-группа переносится с фермента на 5/-фосфат донора. Образование 5/>5/ ангидридной связи активирует 5/-фосфат донора для последующей реакции. Образование активированного донора стимулируется присутствием акцептора.
Акцептор является не только субстратом в реакции, но и кофактором для аденилирования молекулы донора. В отсутствии 3/-OH группы активированный промежуточный продукт не образуется [35] Стимулирование акцептором переноса аденила с фермента на донор может служить для согласованной реакции, чтобы убедиться, что акцептор находится на поверхности фермента