Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
?е) центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Супернатант убрали, образцы заморозили при -200С. К размороженному осадку добавляли лизирующий буфер, объем которого расiитывался по пропорции:
плотности 0,32 - соответствует 50мкл буфера
измеренной плотности - соответствует Х мкл буфера
Гомогенизировали клетки в соответствующем количестве лизирующего буфера, образцы кипятили в течение 4 минут, после чего наносили на электрофорез (по 10 мкл каждого образца). Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле, буфер "Laemmly". После окончания электрофореза окрашивали гель красителем Кумасси. Затем несколько раз отмывали гель при 100oС. Индукция экспрессии генов ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы представлена на рисунках 6, 7, 9, 10, соответственно.
2.2.10 Распределение белка по растворенной и нерастворенной фракциям
50 мл индуцированных клеток центрифугировали на центрифуге Janetzki K23 5 мин при 5000 об/мин. Убрали супернатант и ресуспендировали клетки в 1/10 начального объема (в 5 мл) буфера (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM ЭДТА). Добавили лизоцим до конечной концентрации 100 мкг/мл (использовали свежеприготовленный раствор лизоцима 10 мг/мл). Затем добавили 1/10 объема (0.5 мл) 1% Triton X-100. Инкубировали 15 мин при 30o С. Поместили образцы в ледяную баню и обработали ультразвуком для разрушения ДНК. Раствор потерял вязкость после обработки ультразвуком два раза по 30 секунд с интервалом 2 мин. Центрифугировали при 12000 об/мин в течение 15 мин при 40oС. Супернатант содержал растворенную фракцию. Часть супернатанта, предназаначенную для электрофоретического анализа, развели в два раза двухкратным лизирующим буфером. Осадок ресуспендировали в 5 мл однократного лизирующего буфера для электрофореза. Нанесли на электрофорез (в 10%-ный ПААГ) по 10 мкл каждого образца [14]. Результат представлен на рисунке. 11. Т4 ДНК-полимераза и полинуклеотидкиназа находились в растворенной фракции (рис. 6, 7, соответственно).
2.2.11 Выделение Т4 ДНК-полимеразы
Культуру колеток E. coli с рекомбинантной плазмидой (содержащей ген 43 фага Т4) выращивали в 4-ех колбах по 350 мл среды LB при 37o С с постоянной аэрацией до плотности А590=0,7 О.Е.. Проводили индукцию экспресии гена ДНК-полимеразы фага Т4 добавлением водного раствора ИПТГ (до концентрации 40 мкг/мл). Клетки выращивали еще 3 часа в тех же условиях. Плотность индуцированной культуры составила А590=1.1 О.Е. Клетки осаждали центрифугированием. Масса осадка составила 4г. Для разрушения клеточной биомассы осадок ресуспендировали в 80 мл буфера (50 мМ Трис-НСl, pH 8,0., 2мМЭДТА). Добавили лизоцим до концентрации 100 мкг/мл (8 мг на 80 мл) и 1/100 объема суспензии 10% ТритонаХ-100 (800мкл). Инкубировали 15 мин при 30o С . Клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А при 10o С (30 с- "озвучивание", 2 мин - пауза, 3 раза) до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в 7 раз. Раствор центрифугировали 40 мин при 16000 об/мин. Экстракт развели в 2 раза 2-х кратным Binding-буфером (10мМ имидазол, 1М NaCl, 40мМ Трис-HCl, pH 7,9), фильтровали через стеклянный фильтр и наносили на колонку с Ni2+-NTA-агарозой. Скорость протекания буфера через колонку 60 мл/час, объем образца 120 мл. Колонку промывали 10 объемами (100 мл) Binding-буфера (5мМ имидазол, 0,5 М NaCl, 20 mMТрис-HCl, pH 7,9), затем 6 объемами (60 мл) Wash- буфера (60мМ имидазол, 0,5М NaCl, 20 mM Трис-HCl, pH 7,9) и 4 объемами (40 мл) Elute-буфера (1M имидазол, 0,5 M NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,9).
2.2.12 Выделение полинуклеотидкиназы фага Т4
Культуру клеток E. coli BL21(DE3) выращивали в жидкой среде LB при 37o C с постоянной аэрацией до плотности А590=0,68. Добавляли ИПТГ (40мг/мл) до конечной концентрации 40 мкг/мл.
Клетки выращивали еще 7 часов при тех же условиях и затем осаждали центрифугированием 6000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мл ТЕ-буфера (10мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1mM ЭДТА) , центрифугировали 10 мин при 6000 об/ мин. Полученную биомассу хранили при -200С.
Для разрушения клеток 6г биомассы (полученной из 2 литров культуры) ресуспендировали в 80 мл Binding-буфера (5мМ имидазол, 0,5М NaCl, 20 мМ Трис-HCl, pH 7,9 ). Далее клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (40 сек "озвучивание", 2 мин. перерыв) в ледяной бане до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в десять раз. Суспензию разрушенных клеток цен.трифугировали 40 мин при 16000 об/мин. Супернатант пропустили через крупнопористый стеклянный фильтр (для устранения грубых загрязнений), нанесли на колонку с Ni2+-NTA-агарозой, промытую водой (3 объема колонки), 50mM NiSO4 (5 объемов), Binding-буфером (3 объема). После нанесения образца колонку промыли 10 объемами Binding-буфера, а затем 6 объемами Wash-буфера (60мМ имидазол, 0,5 М NaCl, 20мМ Трис-HCl, pH 7,9) и 6 объемами Elute-буфера (1М имидазол, 0,5 М NaCl, 20мМ Трис-HCl, pH 7,9). Фракции, содержащие фермент, объединили, измерили концентрацию полинуклеотидкиназы (по поглощению при длине волны 280 нм). Расiет коэффициента экстинции проводили по формуле ?280= (NTrp*5,500 + NTyr*1,490 + NCys*0,125)/Mr, согласно [48]. В расiет брались только Cys свободные, не участвующие в образовании дисульфидных связей.
2.2.13 Выделение РНК-лигазы фага Т4
Выделение РНК-лигазы фага Т4 проводили в две стадии.
- Выделение фермента на Ni-NTA-агарозе, проводили так же, как и в случае выделения полинуклеотидкиназы. Не удалось очистить фермент от других белков (рис. ), по этому было принято решение провести еще одну стадию выделения.
- Фракции, содержащие Т4 РНК-лигазу, объединили и нанесли на колонку с голубой агарозой объемом 10 мл, уравновешенную буфером Е(50 мМ Трис HCl, pH 7,5., 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ). Элюцию проводили 100 мл градиента 0-2М KCl в буфере Е со скоростью 20 мл/час (рис. ). Фр