Geum.ru


Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8

Дипломная работа - Биология

Другие дипломы по предмету Биология



зы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8.

Для достижения данной цели необходимо было выполнить две задачи:

  1. Разработать универсальный метод клонирования фрагментов ДНК, полученных с помощью ПЦР.
  2. Получить важнейшие генетические ферменты, необходимые в нашей лаборатории.

1. Обзор литературы

.1 Бактериофаг Т4

Бактериофаг Т4 относится к крупным фагам Т-четного ряда. ДНК фага Т4 линейная, двухцепочечная, имеет молекулярную массу 120*106, длину 165 тыс. пар оснований., которой достаточно для кодирования примерно 200 генов [1,2]. Было определено положение на генетической карте почти 100 генов фага (рис. 1) [1] . Для молекул ДНК фага характерна концевая избыточность (длина этих участков составляет несколько процентов от всей длины ДНК, т.е. несколько тысяч пар оснований). Молекулы ДНК фага одинаковы по величине и генетическому составу, но гетерогенны по нуклеотидной последовательности (в результате циклических перестановок генов).

Т4- очень крупный фаг, который имеет достаточно полный и независимый репликативный аппарат. В течение одной минуты после адсорбции фага Т4 синтез молекул хозяина почти полностью прекращается, начинается транскрипция некоторых фаговых генов и через 4 минуты уже идет репликация фаговой ДНК. Инфекция фагом Т4- прекрасная модель для изучения контроля репликации и экспрессии генов [1].

Репликация ДНК фага Т4 начинается в точке, расположенной между генами 42 и 43 и идет в двух направлениях. Позже возникает много точек репликации, в результате чего образуется до 60 репликативных вилок.

Одно из преимуществ использования фага Т4 как модельной системы для изучения репликации ДНК заключается в том, что все белки, необходимые для элонгации цепи, кодируются фагом. Идентифицированно 11 белков, участвующих в формировании и передвижении репликативной вилки, но только 5 из них необходимы для создания коровой системы [3]. Это продукты генов 43 (Т4 ДНК полимераза), 32 (белок, связывающий одноцепочечную ДНК), 44, 62, 45 (вспомогательные белки). Взаимодействие этих белков определяет точность репликации [1, 3].

В состав ДНК фага Т4 (и других Т-четных фагов) вместо обычного цитозина. входит необычное основание- оксиметилцитозин (ОМЦ). Большинство остатков ОМЦ глюкозилировано [1,4,5]. ДНК с такими модифицированными основаниями не разрезают почти все известные рестриктазы [4]. Ферменты рестрикции E.coli узнают неглюкозилированные остатки ОМЦ в определенных последовательностях, и разрушают такую ДНК. Т-четные фаги не только защищаются от хозяйских рестриктаз, но и кодируют нуклеазы, деградирующие немодифицированную ДНК хозяина, которые не действуюют на фаговую ДНК.

Гликозилирование остатков ОМЦ в ДНК фага Т4 генетически детерминировано, оно происходит путем переноса гликозильных остатков на ДНК в течение нескольких минут после полимеризации с помощью специфических ферментов - гликозилтрансфераз. Такой способ борьбы мог возникнуть только у такого крупного фага, как Т4 [1].

1.2 ДНК-полимеразы

Ферменты ДНК-зависимые ДНК-полимеразы осуществляют комплементарное копирование матрицы. Первый фермент этого типа был открыт в1956 году у E.coli. Эти ферменты последовательно наращивают конец затравки, присоединяя к нему поступающие нуклеотиды [4].

Биосинтез ДНК имеет две основные особенности:

  1. Фосфодиэфирная связь образуется между 3'-гидроксильной группой на конце растущей цепи ДНК, называемой затравкой, и 5'-фосфатной группой очередного дезоксирибонуклеотида. Общее направление роста цепи от 5'-конца к 3'-концу.
  2. Каждый дезоксинуклеотид отбирается с помощью спаривания с основанием цепи ДНК, называемой матрицей.

Очередной нуклеотид поступает в реакцию в активированной высокоэнергетической форме дезоксирибонуклеозидтрифосфата. В случае синтеза ДНК присоединение очередного нуклеотида к концу затравки сопровождается гидролизом богатой энергией связи и отщеплением пирофосфата, что делает реакцию в целом энергетически выгодной.

  1. Для синтеза ДНК необходима затравка, содержащая 3'-гидроксильную группу, инициация новых цепей невозможна.
  2. Под действием 3'-5'-экзонуклеазной активности полимеразы удаляется основание, которое возникает в результате ошибочного встраивания. Таким образом достигается достаточно высокая точность и надежность репликации.
  3. Растущая цепь и матрица антипараллельны.
  4. Копируется любая последовательность оснований матрицы [1].

В качестве праймера может служить не только ДНКовая но и РНКовая затравка. Т.к. ДНК-полимераза не может осуществлять синтез без затравки, то необходимо, чтобы затравка синтезировалась каким-либо другим ферментом, например, РНК-полимеразой [5].

1.3 Общие свойства ДНК-полимеразы фага Т4

Т4 ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, продуктом гена 43 бактериофага Т4. T4 ДНК-полимераза состоит из одного полипептида молекулярной массы 114 кДа [2].

Фермент катализирует полимеризацию нуклеотидов в направлении 5'-3', обладает очень высокой 3'-5' экзонуклеазной активностью, которая намного более эффективна на одноцепочечной ДНК, чем на двухцепочечной. Полимераза не имеет 5'-3' экзонуклеазной активности. Для работы фермента необходима ДНК с выступающим 5'-концом и высокая концентрация нуклеотидтрифосфатов.

Для своей активности требует ионы Mg2+ . Оптимальный рН 8-9; при рН 7.5 или 9.7 активность составляет только 50%. Фермент не активен при контактировании с