Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
м случае делают ПЦР с геномной ДНК или кДНК с использованием одного специфического праймера (А) к 3/-концу определенного гена. К 3/-концу одноцепочечного продукта реакции (последовательность этого конца неизвестна) "пришивается" лигируется олигонуклеотид В (с любой выбранной последовательностью нуклеотидов) с помощью Т4 РНК-лигазы (рис. 4). Затем для получения двухцепочечного фрагмента проводится ПЦР с использованием праймеров А и С ( С комплементарен праймеру В) . Далее можно лигировать полученный фрагмент с вектором [45].
2. Экспериментальная часть
.1 Материалы
В работе использовались следующие реактивы: NaCl, KCl(о.с.ч ) , MgCl2, HClO4, KH2PO4, K2HPO4, NaOH, Трис-основание (Serva, Германия), БСА, ДТТ, АТФ (Sigma, США), ЭДТА (о.с.ч), бромид этидия (Serva, Германия), агароза (Bio-Rad, США), легкоплавкая агароза (Sigma, США), бактопептон, бактотриптон, глицерин, ацетат натрия, (NH4)2SO4, полиимин Р (BRL, США), фенилметилсульфонилфторид, дрожжевой экстракт (Difco, США), дезоксинуклеотидтрифосфаты (Sigma,США), [?-32P]ATP, желатина, гуанидинтиоционат (Fluka), изопропил ?-D-тиогалактозид (IPTG), "стеклянное молочко"-silica (Merc, Германия), фенол, этанол,хлороформ, изопропанол, имидазол, NiSO4.
Реактивы для белкового электрофореза: акриламид, N,N'метилен-бисакриламид, персульфат аммония (Reanal, Венгрия),ТЕМЕД, Кумасси G250 (Serva, Германия), ?-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия (SDS).
Белки и ферменты: сайт-специфические эндонуклеазы BspIS4 I, Xho I, Nco I, Nsi I, Sph I, BspLu11 II, Bli736 I, Paq I, термостабильные ДНК-полимеразы Taq и Pfu, лизоцим, ДНК-лигаза фага Т4
Препараты ДНК: ДНК бактериофага Т4 (частично глюкозилированная), в качестве вектора для клонирования использовали плазмиды pET-21d и pET-28b
Штамм E.coli BL21DE3: F- ompT[Ion] hsdSB (rB-mB-, E.coli B штамм, ? профаг, несущий ген Т7 РНК-полимеразы.
В работе использовались центрифуги: "Eppendorf", "Janetzki K23", прибор для проведения ПЦР "Mastercycler gradient" (Eppendorf).
Для проведения электрофорезов использовались: источники питания ИПФ-1, ИПФ-2; аппараты для электрофореза, изготовленные в мастерских Института Белка РАН.
Для выделения ДНК из легкоплавкой агарозы использовались стеклянный фильтр Glass microfibre paper (GMP) (Whatman, Англия), 60% спирт (100mM NaCl, 10mM Tris, pH 7.5, 1mM ЭДТА).
Бактериальные жидкие среды:
LB: 1% бакто-триптон (Difco, США), 0.5% дрожжевой экстракт (Difco, США), 1% NaCl, pH 7.0;
SOC-среда: 2% пептон, 0,5% дрожжевой экстракт, pH 7.0, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM глюкозы.
Буферные растворы:
Буфер К (для приготовления компетентных клеток): 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 70 mM CaCl2, 50 mM MgCl2.
Среднесолевой буфер MRB: 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 mM DTT, 1 мг/мл.желатина
Высокосолевой буфер HRB: 20 мМ Трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 10 mM DTT, 1мг/мл желатина.
LIGB буфер для ДНК-лигазы фага Т4: 50 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 10 мМ MgCl2, 10mM DTT, 1мМ АТФ, 25 мкг/мл БСА.
TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM ЭДТА: 89 mM Tris-борат, 2 mM ЭДТА.
Х TermoPol буфер для Taq- и Pfu-ДНК-полимераз: 10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl ( pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100.
Хроматографические носители:
Фенил-сефароза, гепарин-сефароза, голубая агароза (Институт химии, Таллин), Ni2+-NTA-агароза.
Антибиотики: ампициллин, канамицин.
Олигонуклеотиды:
F1 5/-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'
F2 5/-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'
С8 5'-AATTCATGAAAAAGATTATTTTG-3'
С5 5'-GCCTCGAGAAAATCTCCCGAAGC-3'
В11 5'-GCGGTCTCGCATGCAAGAGCTTTTTAAC-3/'
B12 5'-GGGCTCGAGGTATCCTTCTGGGATA -3'
А9 5/- GCCGGTCTCCCATGGAGGCGATGCTTCCG-3/
А8 5/-CCGGAATTCTAACCCTTGGCGGAAAGC-3/
Олигонуклеотиды синтезированы фирмой "СИНТОЛ", г. Москва.
2.2 Методы
2.2.1 Амплификация последовательностей генов
Для амплификации фрагмента, содержащего последовательность гена 43, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в 20 мкл реакционной смеси.
Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:
F1(к 5'-области гена)5'-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'
F2(к 3'-области гена)5'-CTAAGGAAGACTCCATGAAAGAATTTTAT-3'
Реакционная смесь содержала: 11,9 мкл Н2О, 2мкл 10x Taq-буфера, олигонуклеотидов-праймеров по 20 пмоль каждого, 2 нг ДНК фага Т4, 0,4 мкл раствора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (конечная концентрация каждого dNTP в реакционной смеси 200мкM), 1 мкл смеси полимераз (Taq и Pfu ).
Был подобран оптимальный температурный режим, составлена программа для прибора (Termal cycler ).
) Денатурация 950 3 мин
) Денатурация 950 30 сек
) Отжиг праймеров 340 30 сек
) Элонгация 720 3 мин
) Повторение цикла (пункты 2-4) 3 раза
) денатурация 950 30 сек
) отжиг праймеров 600 30 сек
) элонгация 720 3 мин
) повторение цикла(пункты 6-8) 20 раз
) финальная элонгация 720 5 мин
Температура отжига расiитывалась для комплементарной части и для полной последовательности олигонуклеотида по формуле: Тm= 20( А-Т )+40( G-C ).
Использовали при проведении ПЦР смесь полимераз Taq+Pfu для точного и быстрого синтеза комплементарных цепей ДНК. Время элонгации вычислялось исходя из скорости работы Taq- и Pfu-полимераз. Taq-полимераза достраивает примерно 1000 оснований за минуту, Pfu- тоже самое выполняет примерно за 2 минуты. Так как основной синтез выполняет Taq-полимераза, то расiет времени элонгации вели исходя из величины амплифицируемого фрагмента ( 2696 пар оснований) и скорости синтеза ДНК, равной 1000 оснований в минуту.
Амплификация последовательности гена полинуклеотидкиназы фага Т4
Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:
С8 (к 5'-области гена) 5'-AATTCATGAAAAAGATTATTTTG'
С5 (к 3'-области гена) 5'-GCCTCGAGAAAATCTCCCGAAGC-3'
Программа:
) Денатурация 95o 5 мин
) Денатурация 95o 30 сек
) Отжиг праймеров 51o 30 сек
) Элонгация 72o 2 мин
) Повторение цикла (пункты 2-4) 25 раз
) финальная элонгация 72o 4 м