Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
?то и в случае гена pseT (клонирование под ATG-кодон вектора pET21-d) по идее можно использовать еще 3 эндонуклеазы: Nco I, Nde I и BspLu11 I, в сайтах узнавания которых тоже содержится старт-кодон. Но в этом случае мы столкнулись с несколькими проблемами:
) В последовательности генов встречался сайт для рестриктазы (Nco I в последовательности гена Tth-полимеразы, Nde I в последовательности гена Т4 ДНК-полимеразы).
) Налагалось условие на второй кодон, если использовать Nco I для клонирования генов ДНК-полимеразы и РНК-лигазы фага Т4, или Paq I для клонирования Tth-полимеразы. Изменение аминокислоты на N-конце белка может приводить к более быстрой его деградации . Данные относительно этой проблемы приводятся в работах Варшавского, который сформулировал правило N-конца (N-rule) [51].
) Эндонуклеаза Nde I плохо гидролизует ДНК на концах фрагментов (0% расщепления , если сайт находится в пределах 18 п.о. с конца молекулы) [52].
Решением этих проблем явилось использование уникального свойства эндонуклеаз II-S типа, заключающееся в том, что эти рестриктазы узнают точный сайт, но расщепляют ДНК в стороне нескольких нуклеотидов от него. Например, использованная нами для клонирования гена Т4 ДНК-полимеразы эндонуклеаза BspIS4 I узнает сайт 5/-GAAGAC-3/, а расщепляет ДНК на расстоянии 2/6 нуклеотидов от него [53] (рис. 8).
Т.к. лучше клонировать ген под старт-кодон вектора, то мы заложили в праймере к 5/-концу клонируемого гена сайт для эндонуклеазы BspIS4I таким образом, чтобы в результате расщепления образовывался такой же липкий конец, что и после действия NcoI (для последующего лигирования с вектором, расщепленным по NcoI-сайту), что показано на рисунке 8.
Возможность использования этого метода была подтверждена на примере клонирования гена РНК-лигазы фага Т4 и гена Tth-ДНК полимеразы из Thermus thermophilus HB8 с использованием другой II-S рестриктазы- Bli736I. На рисунке 8 изображен сайт узнавания для этой эндонуклеазы и структура праймеров, использованных для амплификации соответствующих фрагментов ДНК.
Индукция экспрессии генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы показана на рисунках 6, 9, 10 соответственно.
3.3 Выделение ДНК-полимеразы и полинуклеотидкиназы фага Т4
Гены этих ферментов были клонированы в pET-вектор таким образом, что на С-конец синтезируемых в последствии белков "навешивался хвост" из 6-ти гистидинов (так называемый His-taq). Такой гистидиновый "хвост" позволяет проводить - афинную хроматографию на Ni2+ -NTA-агарозе. Таким образом белки можно очистить за одну стадию [54]. Осветленный лизат бактериальной массы наносили на колонку с Ni2+-NTA-агарозой. После этого проводили промывку Wash и Elute буферами (концентрация имидазола 60мМ и 1М, соответственно). Т4 ДНК-полимераза элюировалась в Wash-буфере (рис.11), а полинуклеотидкиназа - как в Wash, так и в Elute-буфере (рис. 12). Таким образом было получено 30 мг Т4 ДНК-полимеразы и около 80 мг Т4 полинуклеотидкиназы.
3.4 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
Определение единицы активности ДНК-полимеразы: Одна единица фермента катализирует включение 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимую форму за 30 мин при 37o С. Удельная активность выражается в единицах активности на миллиграмм фермента.
Реакцию проводили в присутствии меченного [?-32P]АТФ. Активность фермента определяли по эффективности включения меченного дезоксинуклеотида. Были получены различные данные, в зависимости от ДНК, используемой в качестве субстрата. Наибольшее значение активности было получено при использовании в качестве субстрата денатурированной ДНК спермы лосося ( 300000 ед/мг). Более низкое значение получено при использовании кольцевой молекулы М13 с универсальным праймером в качестве затравки ( 151345 ед/мг).
3.5 Выделение РНК-лигазы фага Т4
Очистку РНК-лигазы проводили в две стадии:
- Выделение на колонке с Ni2+-NTA-агарозой проводили аналогично вышеописанному случаю. Элюировали белки градиентом концентрации имидазола ( 5мМ- 1М). Но в этом случае не удалось избежать примесей других белков, в связи iем пришлось проводить дополнительную стадию очистки. Результат хроматографии представлен на рис.13.
- Очистка на колонке с голубой агарозой (рис. 13). Этот носитель служит для выделения АТФ-связывающих белков, одним из которых является РНК-лигаза. Элюирование проводили градиентом концентрации 0-2 M KCl. Фермент элюировался в диапазоне концентраций KCl от 200 до 800 мМ.
В итоге получили 5,2 мг фермента с одного грамма клеточной биомассы.
3.6 Выделение Tth ДНК-полимеразы
Выделение Tth-полимеразы проводили согласно методике очистки Taq-полимеразы [9], предполагая, что ферменты при очистке должны вести себя сходным образом, т.к. имеют много общих свойств (высокий процент гомологии).
Очистка Tth-полимеразы включала две стадии (рис. 14):
- Хроматография на колонке с фенил-сефарозой. Фермент элюировался в диапазоне концентраций мочевины от 1 до 2,8 М. Фракции, содержащие полимеразу, объединили для следующей стадии очистки (рис. 15).
- Хроматография на колонке с гепарин-сефарозой (рис. 15). Фермент с колонки элюировался в диапазоне концентраций от 166 до 266 мМ КCl.
Всего было получено 2,4 мг фермента с 3 граммов клеточной биомассы (из 2л культуры).
3.7 Активности РНК-лигазы и полинуклеотидкиназы фага Т4
Из литературных источников найдены значения удельных активностей для РНК-лигазы (2180 единиц/мг белка) и полинуклеотидкиназы (62000 единицы/ мг белуа). Зная количество выделен