Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
?войной цепью как с матрицей. Для полимеразной активности требует одноцепочечную ДНК с затравкой, дуплексную ДНК с разрывами(повреждениями).
Определение единицы активности: Одна единица фермента включает 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимые продукты с денатурированной, обработанной ультразвуком ДНК тимуса теленка как матрицей, за 30 мин при 37о С.
Для Т4 ДНК-полимеразы известен PDB-код: 1NOY.
Таблица 1. Свойства наиболее изученных полимераз [1, 6, 7,8,9,10,11,12].
ПолимеразаMr5/-3/ exo3/-5/ exoУровень ошибокНик - трансляцияСкорость удлине-нияТ опт.(?C)ПроцессивностьТемпературная инактива-ция 75?CТермостабильностьДНК-полимераза I E. Coli109++9x10-6+3750+-Фрагмент Кленова-+40x10-6-3712+-T4 ДНК-полимераза114-+Taq-pol72-
1.4 ДНК-полимераза из T. thermophilus HB8
Tth-ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, состоит из одного полипептида молекулярной массы 94 кДа. Длина полипептидной цепи 834 аминокислотных остатка. Полимераза обладает 5/-3/-экзонуклеазной активностью и не имеет 3/-5/-экзонуклеазной (корректирующей) активности [13].
Оптимум рН для ПЦР с Tth-полимеразой находится в пределах от 8,5 до 9,0 [14]. Присутствие 0,01%-ного Твина-20 значительно повышает эффективность ПЦР c участием этой полимеразы, а добавление 0,01%-ного желатина ингибирует ее. Оптимальная концентрация каждого из пары праймеров для данной системы составляет 0,3 мМ. Показана возможность амплифицировать фрагменты ДНК длиной от 500 до 8500 п. н [14].
Одно из замечательных свойств Tth-полимеразы - способность фермента осуществлять синтез ДНК по цепи РНК в качестве матрицы. То есть было обнаружено, что данная полимераза обладает обратно-транскриптазной (ревертазной) активностью. Этот факт послужил стимулом для использования этого фермента в совмещенной реакции обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР).
Раньше часто проблематично было синтезировать к-ДНК используя мезофильные вирусные обратные транскриптазы из-за встречающихся в РНК стабильных вторичных структур. Различные методы описывают способы дестабилизации комплементарных районов: использование ДМСО, повышение температуры реакции и некоторые другие. Но добавление в реакционную смесь таких соединений и повышение температуры плохо сказывались на мезофильных ферментах.
Многие проблемы, связанные с большим содержанием вторичной структуры, присутствующей в РНК, минимизировались с использованием термостабильной ДНК полимеразы для обратной транскрипции. Стало возможным получать полноразмерные фрагменты ДНК и сразу амплифицировать их с использованием того же фермента. До Tth-полимеразы для этих целей применяли Taq-полимеразу. Но позже выяснили, что Tth-полимераза в 100 раз более активна в сопряженной реакции ОT/ПЦР [13, 15]. Чувствительность реакции, выполненной с использованием Tth-полимеразы позволяет детектировать (обнаруживать) продукт, полученный со 100 копий синтетической к-РНК [13]. В других работах удалось выявить этим же методом 103 копий РНК интерлейкина 2? (IL-2?) [15] и получить исходя из 400пг суммарной РНК кДНК для мРНКинтерлейкина 1?. Причем слабый сигнал на агарозном гель-электрофорезе наблюдали уже при введении в реакцию 80 пг суммарной мРНК, что эквивалентно 10 клеткам [16].
Эффективность ревертазной стадии ОТ/ПЦР в присутствии различных двухвалентных катионов убывает в ряду: Mn2+ > Cu2+ > Mg2+ > Cd2+ >> Co2+. Показано, что использование Mn2+ вместо Mg2+ на стадии ПЦР приводит к снижению эффективности ОТ/ПЦР. В связи с этим авторы статьи после реакции обратной транскрипции (в присутствии 1 мМ MnCl2) связывали ионы Mn2+ EGTA (так как EGTA имеет более низкое сродство к Mg2+, чем к Mn2+ и другим двухвалентным катионам) и далее проводили ПЦР в присутствии 1,5 мМ Mg2+ [15].
Процесс ОT/ПЦР оказался бесценным для выявления экспрессии генов, для амплификации последовательности РНК, последующего субклонирования и анализа, для диагностики инфекционных агентов или генетических заболеваний [13].
Очень интересна работа Игнатова К.Б с соавторами по рассмотрению различий в свойствах Taq- и Tth-полимераз и их возможная связь с аминокислотной последовательностью субдомена "большой палец" [17].Ранее был проведен сравнительный анализ консервативных областей полимеразного домена различных ДНК-полимераз и показано, что консервативный участок субдомена "большой палец" определяет способность ДНК-полимераз связываться с дуплексом матрица-праймер и влияет на процессивность фермента. Авторы сопоставили аминокислотные последовательности "большого пальца" и прилегающего к нему участка этих полимераз и Tth-полимеразы (рис. 2 ). Был заменен фрагмент Pvu I -BamH I гена Tth-полимеразы, кодирующий 492-595 аминокислотные остатки на соответствующий участок гена ДНК-полимеразы I E. coli, кодирующий 103 аминокислоты (586-688). Удалось получить экспресиию гибридного гена, продукт которого, названный Teco-полимеразой, был активен. В другом случае был заменен фрагмент Pvu I-BamH I гена Tth-полимеразы аналогичным фрагментом гена Taq-полимеразы (рис. 2), что привело к замене всех восьми неидентичных аминокислотных остатков в консервативной области "большого пальца". Новый фермент назвали Ttaq-полимеразой.
Ферментативные активности сравнивались при 72o С для Tth- и Taq-полимераз и при 52o C для Tth- и Teco-полимераз. Было обнаружено, что внесенные мутации не вызвали существенного изменения их удельной активности. Температурный оп