Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
?имум Tth-, Taq- и Ttaq-полимераз находится в области 70-72o С, а Teco-полимеразы- в области 50-52o С. Tопт Teco-полимеразы на 15o С выше и на 20o С ниже Топт ДНК-полимеразы I E. coli и Tth-полимеразы соответственно. Более высокую, по сравнению с ДНК-полимеразой I E. coli, температуру функционирования Teco-полимеразы авторы объясняют влиянием термостабильных участков. Teco-полимераза является примером возможности создания функционально активных гибридов термостабильной и мезофильной ДНК-полимераз.
В работе показано, что оптимальной концентрацией Mg2+ для Taq-полимеразы является 2 мМ, а для Tth-, Ttaq- и Teco-полимеразы- 5 мМ. Далее была исследована способность полимераз амплифицировать фрагменты ДНК разной длины. ПЦР проводили при 1,5 мМ MgCl2. При амплификации относительно короткого фрагмента ДНК более эффективной оказалась Taq-полимераза, но при амплификации более протяженных участков (больше 5000 п. о.) выход продукта на единицу активности фермента в случае Tth-полимеразы был значительно выше, чем при использовании Taq- и Ttaq-полимераз. Наличие некомплементарного нуклеотида на 3/-конце синтезируемой цепи не влияет на эффективность синтеза ДНК Ttaq-полимеразой. Это свидетельствует о том, что Ttaq- так же, как и Tth-полимераза нечувствительна к наличию 3/-некомплементарного нуклеотида [17].
1.5 Полинуклеотидкиназа фага Т4
Полинуклеотидкиназа фага Т4 (EC2.7.1.78)- продукт раннего гена pseT фага Т4.
Полинуклеотидкиназа катализирует перенос ?-фосфата от АТФ на 5/-OH конец ДНК, РНК или олигонуклеотида . Минимальным субстратом может служить нуклеотид-3/- фосфат [18,19]. Фосфорилирование 5/-концов ДНК с помощью АТФ можно детектировать в экстрактах E. coli, инфицированных фагом Т4 уже через пять минут после инфекции. Максимальный уровень активности фиксируется через 20 минут после инфекции [19].
Фермент так же имеет 3/-фосфатазную активность (удаление 3/-фосфатной группы), которая предпочитает ДНК в качестве субстрата [18].
Было выявлено, что эти две активности катализируются аминокислотными остатками, локализующимисяся в разных активных сайтах полипептидной цепи [20]. Специфическое расщепление экзопептидазой выявило, что киназная активность находится в N-концевой части, а фосфатазная активность- в С-концевой части полипептидной цепи. С помощью частичного расщепления трипсином был получен фрагмент белка 29 кДа, который не обладал киназной активностью, но имел почти нормальную 3/-фосфатазную активность [20].
Реакцию, катализируемую полинуклеотидкиназой фага Т4 можно представить следующим образом:
АТФ + 5/-OH ДНК (РНК) - АДФ + 5/-Ф ДНК (РНК)
Физико-химические свойства полинуклеотидкиназы.
Фермент является олигомером, состоит из четырех идентичных субъединиц (мономеров), каждая из которых сама по себе не обладает плинуклеотидкиназной активностью. Молекулярная масса мономера 33 кДа, что было определено с помощью аминокислотного анализа и SDS-гель-электрофореза [21]. Гель-фильтрацией была определена молекулярная масса активной полинуклеотидкиназы-140 кДа.
Фенилаланин является N-концевой аминокислотой. Каждый мономер содержит две SH-группы. Высокая ионная сила раствора (0,1М KCl), спермин, АТФ, тимидин-3/-монофосфат являются компонентами, стабилизирующими олигомерную структуру фермента [21].
Оптимальным рН для реакции фосфорилирования является 7,4-8,0 в Трис-буфере. При рН 7,6 в 0,07 М Na- или К-фосфатном буфере наблюдается лишь 5%-ная активность, по сравнению с активностью в Трис-буфере.
Необходимо присутствие катионов двухвалентных металлов. Оптимальная концентрация Mg2+ в реакционной смеси- 10мМ. Mn2+ может лишь частично заменять Mg2+. При использовании Mn2+ в оптимальной концентрации 3,3 мМ сохраняется 50% активности, наблюдаемой в присутствии Mg2+. В отсутствии ?-меркаптоэтанола наблюдается активность, соответствующая двум процентам от максимальной активности [21].
Оптимальный рН для дефосфорилирования 3/-концов равен 6,0. Фосфатазная активность не требует присутствия АТФ, более эффективна при взаимодействии фермента с дезоксирибонуклеотидами, чем с рибонуклеотидами. Максимальная фосфатазная активность проявляется при концентрации Mg2+ от 3 до 10 мМ. Ионы Mg2+ могут быть заменены ионами Co2+ без заметных изменений в скорости реакции. Но Mn2+, Zn2+ илиCa2+ не способны заменить Mg2+. Не смотря на то, что сравнительно низкая фосфатазная активность наблюдается уже при рН 8,0, перенос 3/-фосфатов с концов олигорибонуклеотидов зафиксирован даже при рН 10,0 [22].
Было установлено, что реакция фосфорилирования обратима. Это можно определить по появлению [?-32P]АТФ из [5/-32P]-меченного олигонуклеотида в присутствии АДФ. Акцептором фосфата может быть не только АДФ, но и АТФ, в результате чего образуется [?-32P]аденозинтетрафосфат [23]. Отимальный рН для этой реакции 6,0.
Сравнение свойств полинуклеотидкиназы фага Т4 и полинуклеотидкиназы из ядер печени крысы.
Полинуклеотидкиназа из ядер печени крысы значительно отличается по своим физико-химическим свойствам от соответствующего фермента фага Т4. Молекулярная масса фермента 80 кДа. Это односубъединичный белок. Оптимальный рН для функционирования 5,5, хотя заметная активность проявляется до рН 8,0. По результатам проведенных опытов можно сделать вывод, что фермент в основном локализован в ядрах клеток [24]. Киназа из ядер печени крысы неактивна на 5/-OH-концах молекул РНК или олигодезоксирибонуклеотидах короче 10-12 оснований. Для этого фермента можно более точно написать уравнение катализируемой реакции:
/-OH конец ДНК + АТФ - 5/-фосфат конец ДНК + АДФ
Этот фермент