Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
ПОЛУЧЕНИЕ СУПЕРПРОДУЦЕНТОВ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, РНК-ЛИГАЗЫ, ПОЛИНУКЛЕОТИДКИНАЗЫ ФАГА Т4 И ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ИЗ Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа
Содержание
Введение
. Обзор литературы
.1 Бактериофаг Т4
.2 ДНК-полимеразы
.3 Общие свойства ДНК-полимеразы фага Т4
.4 ДНК-полимераза из T. thermophilus HB8
.5 Полинуклеотидкиназа фага Т4
.6 РНК-лигаза фага Т4
. Экспериментальная часть
.1 Материалы
.2 Методы
.2.1 Амплификация последовательностей генов
.2.2 Очистка фрагментов ДНК
.2.3 Подготовка вектора
.2.4 Подготовка фрагментов ДНК
.2.5 Лигирование
.2.6 Трансформация клеток E. Сoli
.2.7 Анализ клонов
.2.8 Клонирование ДНК-полимеразы фага Т4
.2.9. Индукция экспрессии генов
.2.10 Распределение белка по растворенной и нерастворенной фракциям
.2.11 Выделение Т4 ДНК-полимеразы
.2.12 Выделение полинуклеотидкиназы фага Т4
.2.13 Выделение РНК-лигазы фага Т4
.2.14 Выделение Tth ДНК-полимеразы
.2.15 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
. Результаты и их обсуждение
.1 Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4
.2 Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы
.3 Выделение ДНК-полимеразы и полинуклеотидкиназы фага Т4
.4 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
.5 Выделение РНК-лигазы фага Т4
.6 Выделение Tth ДНК-полимеразы
.7 Активности РНК-лигазы и полинуклеотидкиназы фага Т4
Выводыписок использованной литературы
Введение
В связи с бурным развитием генной инженерии все больше возрастает значение и масштабы применения ферментов для необходимых манипуляций в этой области. Ферменты репликации ДНК- ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназа и РНК-лигаза фага Т4 приобрели важное значение как инструменты конструирования и изучения рекомбинантных ДНК.
В настоящее время среди полимераз наиболее широко используются ДНК-полимеразы фагов Т4 и Т7, ДНК-полимераза из термофила T. aquaticus. Все большее значение приобретает ДНК-полимераза из T. thermophilus.
Эти ферменты имеют свои аспекты применения и не могут быть полностью взаимозаменяемы в генноинженерных манипуляциях.
Т4 ДНК-полимераза отличается от остальных подобных ферментов тем, что обладает очень высокой корректирующей активностью т.е. редко ошибается, при этом быстро синтезирует новые цепи ДНК. 3'-5'-экзонуклеазная активность в 200-400 раз превосходит аналогичную способность фрагмента Кленова.
Т4 ДНК-полимеразу очень удобно использовать в системе ALTER для сайт-специфического мутагенеза, по этому возникла необходимость клонирования и получения полимеразы фага Т4.
В связи с бурным развитием и применением техники ПЦР огромное значение приобрели термофильные ДНК-полимеразы. Уже известно несколько таких ферментов, но не один из них не является универсальным. По этому выбор полимеразы делается в зависимости от конкретных практических задач.
На что в первую очередь обращают внимание при выборе этого инструмента генной инженерии?
) Термостабильность. Все полимеразы, используемые в ПЦР устойчивы к повышенным температурам. Для них ввели такую характеристику, как время полужизни фермента при температурах 90-100? С. Предпочтение отдается тем полимеразам, у которых этот показатель выше, т.к. появляется возможность увеличения количества циклов в реакции.
) Скорость синтеза ДНК. Проблема амплификации длинных фрагментов ДНК решается с использованием полимераз, способных осуществлять синтез ДНК с высокой скоростью. Одними из таких полимераз являются Stoffel-фрагмент и Tth-полимераза.
) Точность синтеза: в случае клонирования каких-либо генов или фрагментов ДНК становится необходимым предотвращение ошибок в нуклеотидной последовательности синтезируемого фрагмента. Таким образом выбираются полимеразы, способные наиболее точно осуществлять синтез новых цепей ДНК. На данный момент примером могут служить Vent- и Pfu-полимеразы.
) Обратно-транскриптазная активность. В связи с необходимостью получения большого количества кДНК-копий с молекул РНК возникает проблема выбора соответствующей полимеразы. Мезофильные ревертазы иногда "не справляются" со своей задачей, т.к. в РНК могут встречаться устойчивые вторичные структуры. Сравнительно недавно открытая обратно-транскриптазная активность у некоторых термофильных полимераз (Taq, Tth) дает возможность решения данной проблемы.
В нашей лаборатории возникла необходимость амплификации протяженных фрагментов ДНК и получения кДНК-копий с молекул РНК. В связи с этим надо было получить Tth ДНК-полимеразу.
Следующие два инструмента генной инженерии- полинуклеотидкиназа и РНК-лигаза фага Т4. Оба фермента очень широко используются для различных целей. Т4 полинуклеотидкиназа осуществляет фосфорилирование 5/-OH концов ДНК (РНК), что широко применяется при секвенировании ДНК.
РНК-лигаза фага Т4 осуществляет соединение одноцепочечных молекул РНК, ДНК, или РНК с ДНК. Этот фермент широко используется при мечении 3/-концов одноцепочечных нуклеиновых кислот и синтезе олигонуклеотидов с заданной последовательностью оснований. Нашей лаборатории необходим этот фермент в связи с потребностью проводить "заякоренный ПЦР" (anchored PCR). РНК-лигаза- незаменимый фермент, используемый в этом процессе.
Итак, целью нашей работы явилось получение суперпродуцентов ДНК-полимера