Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
ин
Амплификация последовательности гена РНК-лигазы фага Т4
Олигонуклеотиды:
В11(к 5'-области гена)5'-GCGGTCTCGCATGCAAGAGCTTTTTAAC-3/'
B12(к 3'-области гена) 5'-GGGCTCGAGGTATCCTTCTGGGATA -3'
Температурный режим:
) Денатурация 95o 5 мин
) Денатурация 95o 30 сек
) Отжиг праймеров 55o 30 сек
) Элонгация 72o 2 мин 20 сек
) Повторение цикла (пункты 2-4) 24 раза
) финальная элонгация 72o 4 мин.
Амплификация последовательности гена Тth-полимеразы
Были синтезированы следующие олигонуклеотиды:
А9 (к 5/-концу ) 5/- GCCGGTCTCCCATGGAGGCGATGCTTCCG-3/
А8 (к 3/-концу) 5/-CCGGAATTCTAACCCTTGGCGGAAAGC-3/
Программа:
) Денатурация 95o 5 мин.
) Денатурация 95o 30 сек.
) Отжиг праймеров 75o 30 сек.
) Элонгация 72o 2 мин 40 ceк.
) повторение цикла (пункты 6-8) 34 раза
) финальная элонгация 72o 4 мин.
клонирование эндонуклеаз рестрикция фаг
2.2.2 Очистка фрагментов ДНК
Для очистки амплифицированных фрагментов ДНК от белков и продуктов неспецифического синтеза ДНК использовали методику выделения ДНК из геля . Проводили электрофорез в легкоплавкой агарозе, затем вырезали участок геля, в котором содержался нужный фрагмент ДНК. Помещали его в прбирку Eppendorf на 2 мл, заливали полностью 4М гуанидинтиоционатом (растворение агарозы), добавляли раствор silica (Merk, Германия) и инкубировали 20 мин при 56o С. Затем центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Осадок стекла ресуспендировали в 200 мкл гуанидинтиоционата, опять центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Точно так же осадок промывали 60% этанолом 3 раза (М Трис-HCl, ). Осадок высушивали, добавляли необходимое количество воды, инкубировали 20 мин при 56o С (элюирование ДНК со стекла). Центрифугировали 3 мин при 3000 об/мин, отбирали супернатант (раствор ДНК).
2.2.3 Подготовка вектора
Использовали плазмиды pET-21d и pET-28b, в полилинкере которых есть сайты для рестриктаз NcoI, XhoI и EcoRI. Для клонирования генов ДНК-полимеразы и РНК-лигазы фага Т4 использовали вектор pET-21d, обработанный эндонуклеазами NcoI и XhoI. Ген Т4 полинуклеотидкиназы клонировали в pET-28b, обработанную теми же эндонуклеазами. Для клонирования гена Tth-полимеразы использовали плазмиду pET-21d, обработанную рестриктазами NcoI и EcoRI. Расщепление проводили одновременно в двух пробах с разными рестриктазами для того, чтобы можно было проследить за полнотой гидролиза ДНК каждым ферментом. Для расщепления вектора внесли 12 мкл (7мкг) ДНК pET-21d (pET-28b), 12 мкл десятикратного буфера для рестрикции (МRB), добавили воды до объема смеси 120 мкл. Из этой смеси отобрали 20 мкл (как контроль), оставшееся количество поделили пополам (по 50 мкл). В одну пробу добавили рестриктазу XhoI (EcoRI), в другую- NcoI. Инкубировали при 37o C 3 часа. Проводили инактивацию ферментов прогреванием при 65o C 20 мин. Полноту гидролиза оценивали по электрофорезу. После полного расщепления вектора первыми рестриктазами, к смеси добавляли вторые рестриктазы (к образцу с плазмидой, расщепленной по сайту XhoI (EcoRI), добавляли NcoI, и наоборот), инкубировали образцы при 37oC 3 часа. Инактивировали ферменты добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 mM. Очистку ДНК вектора проводили с помощью выделения из геля (легкоплавкая агароза) по методике, описанной выше.
2.2.4 Подготовка фрагментов ДНК
Фрагмент ДНК, содержащий ген Т4 ДНК-полимеразы, полученный с помощью ПЦР, обрабатывали рестриктазами XhoI и BspIS4I [15], сайты для которых были заложены в синтезированных олигонуклеотидах. Сначала проводили рестрикцию с XhoI (при 37o C), т.к. эта рестриктаза инактивируется прогреванием при 65o C 20 минут. Для рестриктазы XhoI есть сайт в олигонуклеотиде 2F2 (к 3'-области гена) и внутри последовательности гена Т4 ДНК полимеразы , по этому делали полный гидролиз. В результате было получено два фрагмента : 2500 (3'-конец гена 43) и 196 пар оснований (5'-конец гена 43). После инактивации XhoI в ту же смесь добавили рестриктазу BspIS4I, для которой был заложен сайт в праймере к 5'-области гена. Инкубировали 30 мин при 48o C, инактивировали фермент добавлением ЭДТА (до конечной концентрации 10mM). Экстрагировали фенолом и смесью фенол:хлороформ (1:1) [46].
Перед экстрацкией к образцу добавляли раствор т-РНК (в качестве соосадителя) до конечной концентрации 20мкг/мл. ДНК осадили этанолом и растворили в 50 мкл ТЕ. Таким образом в растворе присутствовали фрагменты гена Т4 ДНК-полимеразы длиной 2500 и 196 п. о.
Фрагменты ДНК, содержащие гены РНК-лигазы и Tth-полимеразы обрабатывались эндонуклеазой Bli736I, сайты для которой находятся в праймерах к 5/-концу гена, и XhoI, EcoRI (сайты для которых заложены в праймерах к 3/-концу генов), соответственно. Фрагмент, содержащий ген полинуклеотидкиназы, обрабатывался эндонуклеазами PaqI (5/-конец) и XhoI.
2.2.5 Лигирование
Реакционная смесь (для случая с Т4 ДНК-полимеразой): ДНК-вставка 10 мкл (400 нг), ДНК-вектор 20 мкл (200 нг), 10х лигазный буфер 4 мкл, АТФ 10 mM- 4 мкл, ДТТ 200mM 1 мкл, Т4 ДНК-лигаза 1 мкл. Инкубация 16 часов при комнатной температуре.
В качестве контроля проводили лигазную реакцию с плазмидной ДНК (pMTL: XbaI ) без вставки. Инактивировали ДНК-лигазу прогревом при 65o 15 мин. Эффективность лигирования оценивали по электрофорезу (переход линейной формы плазмидной ДНК в кольцевую).
Лигирование молекул вектора и фрагмента (с геном полинуклеотидкиназы фага Т4) проводилось в 20 мкл реакционной смеси, содержащей: 2 мкл lig- буфера, 2 мкл 10 мМ АТФ, 2мкл 50мМ ДТТ, 6 мкл (190 нг) pET-28b:NcoI:XhoI , 8 мкл (40нг) ДНК-вставки, 1 мкл ДНК-лигазы фага Т4. Пробу инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре. Затем лигазу инактивировали прогреванием 20 мин при 75o С.
2.2.6 Трансформация клето