Geum.ru


Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8

Дипломная работа - Биология

Другие дипломы по предмету Биология



ных ферментов мы предполагаем, что суммарная активность РНК-лигазы равна 11336 единицам, а активность полинуклеотидкиназы равна 4960000 единиц.

Выводы

  1. Разработан новый универсальный метод клонирования фрагментов ДНК с использованием II-S типа эндонуклеаз рестрикции.
  2. Получены суперпродуценты ДНК-полимеразы, полинуклеотидкиназы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth ДНК-полимеразы из штамма T. thermophilus HB8.
  3. Выделены две ДНК-полимеразы: фага Т4 и T. thermophilus HB8. Оба фермента очищены до функционально чистого состояния. Выход Т4 ДНК-полимеразы составил 7,5 мг с одного грамма клеточной биомассы. Получено 2,4 мг Tth ДНК-полимеразы. Выход белка составил 0,8 мг с грамма биомассы.
  4. Активность ДНК-полимеразы фага Т4 составляет примерно единиц на мг белка.
  5. Выделено 5,2 мг РНК-лигазы фага Т4. Выход белка составил 0,4 мг с грамма клеточной биомассы.
  6. Выделена полинуклеотидкиназа фага Т4. Выход белка составил 13 мг с грамма клеточной биомассы.
  7. Ожидаемая суммарная активность Т4 РНК-лигазы 11336 единиц , Т4 полинуклеотидкиназы - 4960000 единиц активности.

Cписок использованной литературы

1) Корнберг А. // Синтез ДНК - 1977.

2) Kenneth J.M. // Enzymology of DNA in replication in procaryotes - Reprinted from the CRC Critical reviews in biochemistry, 1984, V. 17, Issue2, p.153.

) Lin T.C., Rush J, SpacerE.K, Konigsberg W. H // Cloning and expression of T4 DNA polymerase - Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1987, v. 84, p.7000.

) Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот - под ред. Спирина А.С., 1990.

) Стент Г., Келиндар Р. // Молекулярная генетика - 1981.

) Kong, Kurcea K.B, Jack W.E. // Characterization of a DNA polymerase from the hyperthermophile Archaea Thermococcus litoralis - JBC, 1993, v. 268, p. 1965.

7) Tabor S, Huber H.E, Richardson C.C // Escherihia coli Thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the Gene 5 protein of bacteriophage T7 - JBC, 1987, v.262, p. 33.

) Longley M.J., Bennet S.E., Mosbaugh D.W. // Characterization of the 5/ to 3/ exonuclease associated with Thermus aquaticus DNA polymerase - Nucl. Acids Res., 1990, v. 18, No. 24, p. 7317-7322.

) Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki R.K., Chang S.Y., Landre P.A., Abramson R.D., Gelfand D.H. //High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5/ to 3/ exonuclease activity - Cold spring harbor laboratory press, 1993, v. 2, p. 275-287.

) Lu C., Erickson H.P. // Expression in Escherichia coli of the thermostable DNA polymerase from Pyrococcus furiosus. - Protein expression and purification, 1997, v. 11, p. 179-184.

) Pfu DNA polymerase. // Instruction manual, Stratagene, 1998.

) AmpliTaq DNA Polymerase, Stoffel Fragment.

) Myers, T.W., Gelfand D.H. // Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. - Biochemistry, 1991, v. 30, No. 31, p. 7661.

14) Глухов А.И., Трофимова М.Е., Гордеев С.А., Гребенникова Т.В., Виноградов С.В., Киселев В.И., Крамаров В.М. // Амплификация последовательностей ДНК фага ? методом полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы. - Молекулярная биология, 1991, том 25, вып. 6, с.1602-1609.

) Гребенникова Т.В., Глухов А.И., Чистякова Л.Г., Киселев В.И., Северин Е.С. //Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus КТП в совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2? и определение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1). - Молекулярная биология, 1995, том 29, вып. 4, с. 930-941.

) Смирнов Ю.В., Чахмахчева О.Г., Ефимов В.А. // Рекомбинантная His6-ДНК-полимераза Thermus thermophilus с активностью обратной транскриптазы.- Биоорганическая химия, 1997, том 23, N 4, с. 257-261.

  1. Игнатов К.Б, Крамаров В.М., Чистякова Л.Г., Мирошников А.И.// Факторы, определяющие различную процессивность ДНК-полимераз Thermus thermophilus и Thermus aquaticus при амплификации ДНК фага ?. - Молекулярная биология, 1997, том 31, N 6, с. 956-961.
  2. Midgley, C.A., Murray, N.E.// T4 polynucleotide kinase; cloning of the gene (pseT) and amplification of its product. - The EMBO Journal, 1985, v.4, p. 2695-2703.
  3. Richardson, C.C. // Phosphorilation of nucleic acid by an anzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1965, v. 54, p. 158.
  4. Soltis, D.A., Uhlenbeck, O.C. // Independent locations of kinase and 3/-phosphatase activities on T4 polynucleotide kinase. - J. Biol. Chem., 1982, v. 257, p. 11340-11345.
  5. Lillehaug, J.R.// Physicochemical properties of T4 polynucleotide kinase. - Eur. J. Biochem., 1977, v. 73, p. 499-506.
  6. Cameron, V., Uhlenbeck, O.C. // 3/-phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. - Biochemistry, 1977, v. 16, p. 5120.
  7. Van de Sande, J.H., Kleppe, K., Khorana, H.J. //Reversal of bacteriophage T4 induced polinucleotide kinase action. - Biochemistry,1973, v. 12, p. 5050.
  8. Teraoka, H., Mizuta, K., Sato, F., Shimoyachi, M., Tsukada, K. // Polynucleotide kinase from rat-liver nuclei - Eur. J. Biochem., 1975, v. 58, p. 297-302.
  9. Levin, C.J., Zimmerman, S.B. // A deoxyribonucleic acid kinase from nuclei of rat liver. - J. Biol. Chem., 1976, v. 251, no. 6, p. 1767-1774.
  10. Harrison, B., Zimmerman, S.B. // T4 polynucleotide kinase: macromolecular crowding increases the efficiency of reaction at DNA termini. - Analytical biochemistry, 1986, v. 158, p. 307-315.
  11. Chaconas, G., Van de Sande, J.H., Church, R.B. // End group labelling of RNA and double stranded DNA by phosphate exchange catalyzed by bacteriophage T4 induced polynucleotide kinase. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, v. 66, p.962-969.
  12. Berkner, K.L., Folk, W.R. // Polynucleotide kinase exchange reaction (Quantitative assay for restriction endonuclease-generated 5/-phosphoryl termini in DNAs). - J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 3176-3184.
  13. Kroeker, W.D., Laskowski, M. // Polynucleotide kinase: functional purification and use in the direct kinetic measurement of single- and double-strand cleavages of DNA by restriction and other endonucleases of limited action. - Analytical biochemistry, 1977, v. 79, pp. 63-72.
  14. Silber, R., Malathi, V,G., Hurwitz, //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, p. 3009-3013.
  15. The Enzymes, 1982, v.XV. T4 RNA ligase.
  16. Lubben, T.H., Gumport, R.I. //The purification of nuclease-free T4-RNA ligase - Biochimica et Biophisica Acta, 1979, v. 562, p. 149-161.
  17. Uhlenbeck, O.C. // T4 RNA ligase - TIBS- March 1983.
  18. Rand, K.N., Gait, M.J. // Sequence and cloning of bacteriophage T4 gene 63 encoding RNA ligase and tail fibre attachment activities - The EMBO Journal, 1984, v.3, p. 397-402.
  19. Sugino, A., Snopek, T.J., Cozzarelli, N.R. //Bacteriophage T4 RNA ligase. - J. Biol. Chem.,1977, v. 252, p. 1732-1738.
  20. Sninsky, J.J., Last, J.A., Gilham, P.T. // The use of terminal blocking groups for the specific joining of oligonucleotids in RNA ligase reactions containing equimolar concentrations of acceptor and donor molecules. - Nucl. Acids Res., 1976, v. 3, p 3157-3166.
  21. Ohtsuka, E., Nishikawa, S., Sugiura, M., Ikehara, M. //Joining of ribooligonucleotides with T4 RNA ligase and identification of the oligonucleotide-adenilate intermediate. - Nucl. Acids Res.,1976, v. 3, p 1613-1623.
  22. Uhlenbeck, O.C., Cameron, V. //Equimolar addition of oligoribonucleotides witn T4 RNA ligase. - Nucl. Acids Res., 1977, v. 4, p 85-98.
  23. Moseman McCoy, M.I., Gumport, R.I. // T4 ribonucleic acid ligase joins single-strand oligo(deoxiribonucleotides). - Biochemistry, 1980, v. 19, p. 635-642.
  24. Krug, M., Uhlenbeck, O.C. // Reversal of T4 RNA ligase - Biochemistry, 1982, v. 21, p. 1858-1864.
  25. Runnels, J.M., Soltis, D., Hey, T., Snyder, L. // Genetic and phisiological studies of the role of the RNA ligase of bacteriophage T4. - J. Mol. Biol., 1982, v. 154, p.