Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
В°кции, содержащие Т4 РНК-лигазу, объединили и диализовали против буфера для хранения (10 мМ Трис HCl, pH 7,5., 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 50% глицерин). Препарат хранили при -20o С. Количество выделенного фермента составило 5,2 мг.
2.2.14 Выделение Tth ДНК-полимеразы
Выделение Tth-полимеразы проводилось согласно методике выделения Taq-полимеразы [9].
Культуру клеток E. coli BL21(DE3) с рекомбинантной плазмидой, несущей ген Tth ДНК-полимеразы, выращивали в жидкой среде LB при 37o C с постоянной аэрацией до плотности А590=0,57. Добавляли ИПТГ до конечной концентрации 40 мкг/мл. Клетки выращивали еще 7 часов при тех же условиях и затем осаждали центрифугированием 6000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировали в 100 мл ТЕ-буфера (10мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1mM ЭДТА) , центрифугировали 10 мин при 6000 об/ мин. Полученную биомассу хранили при -20o С.
Для разрушения клеток 3г клеточной биомассы ресуспендировали в 30 мл буфера для выделения (50 мМ Трис НCl рН 7,5, 1мМ ЭДТА, 1,25 мМ PMSF, 2 мг/мл лизоцима). После инкубации в течение 15 минут при 20o С клетки разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-А (2 мин. "озвучивание", 1 мин. перерыв) в ледяной бане до уменьшения оптической плотности при длине волны 590 нм в десять раз. Для денатурации белков с нуклеиновых кислот к лизату при постоянном помешивании и 4o С добавляли по каплям сульфат аммония до концентрации 0,2М.
Суспензию разрушенных клеток центрифугировали 30 мин при 20000 об/мин на центрифуге Beckman LS-75 (ротор T35, Beckman, США). Для денатурации белков E. coli супернатант прогревали при 75o С в течение 30 минут. Затем к раствору при постоянном помешивании добавили полиимин Р до концентрации 0,6% при 4o С. Раствор инкубировали 2 часа на льду, а затем центрифугировали 30 мин при 20000 об/мин. Супернатант был нанесен на колонку с фенил-сефарозой объемом 6 мл, уравновешенную буфером А(50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА), содержащим 0,2 М сульфат аммония. Промыли колонку буфером А, содержащим 20% глицерин (wt/vol). Элюцию связавшихся белков проводили 100 мл линейного градиента концентрации мочевины (0-4М) на буфере А со скоростью 10мл/час. Собирали фракции по 5 мл. Оптический профиль элюции определяли по поглощению при 280 нм в проточном спектрофотометре UV-1 ("Pharmacia", Швеция). Фракции, содержащие Tth-полимеразу, объединяли и диализовали в течение ночи против буфера Б (100мМ KCl, 50мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,1мМ ЭДТА, 0,2% Tween20). Диализованный препарат наносили на колонку с гепарин-сефарозой, уравновешенную буфером Б. Элюцию вели 60 мл градиента 100-700 мМ KCl в буфере Б со скоростью 10 мл/час. Фракции собирали по 3 мл. Фракции, содержащие Tth-полимеразу, объединили и диализовали против буфера для хранения (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 100мМ KCl, 0,1мМ ЭДТА, 1мМ дитиотрейтол, 0,2% Tween20, 50% глицерин). Диализованный препарат хранили при -20o С.
2.2.15 Определение активности ДНК-полимеразы фага Т4
Определение активности фермента проводили согласно методике, предложенной Корнбергом [49].
Определение единицы активности: Одна единица фермента катализирует включение 10 нмоль всех дезоксинуклеотидов в кислотонерастворимую форму за 30 мин при 37o С. Удельная активность ДНК-полимеразы выражается в единицах на миллиграмм фермента.
Реакционная смесь содержала: 67мМ Трис-HCl, pH 8,8., 6,7 мM MgCl2, 1мМ ДТТ, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мг/мл БСА, 0,033мМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP), 10 ?Сi [? -P32] dTTP или dATP денатурированную ДНК спермы лосося или активированную ДНК тимуса теленка.
Буфер для разведения фермента: 67мМ Трис-HCl, pH 8,8., 6,7 мM MgCl2, 1мМ ДТТ, 16,7 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мг/мл БСА.
В пробы для измерения активности (объем 50 мкл) вносится 1мкл фермента из различных разведений. В качестве контроля берется проба без добавления фермента (фоновое включение dNTP в отсутствии ДНК-полимеразы). Инкубация 30 мин при 37o С. Далее следует 2 варианта:
Вариант 1: Пробы наносятся на ДЕАЕ-бумагу, которая затем промывается 3 раза в 0,5 М Na2HPO4 (pH 7,0) [50]. Бумагу можно оставить влажной до измерения количества импульсов.
Вариант 2: Образцы наносятся на фильтр GFC (Whatman). Фильтры высушиваются и промываются 3 раза по 2 мин в 200 мл раствора 200 мМ Na4P2O7, 5% ТХУ(охлажденной на льду), после чего промываются 70% этанолом и высушиваются [50].
Измеряется радиоактивный фон среды (количество импульсов), затем измеряется количество импульсов, которое дает каждая проба. В качестве контроля - проба не инкубированная и не содержащая фермент (измеряется количество импульсов, которое дает сама метка). Вычисляется процент включения dNTP от суммарной метки в реакции. Отсюда можно выяснить количество dNTP, включившихся за время инкубации (нам известно количество dNTP в реакционной смеси) и активность полимеразы.
3. Результаты и их обсуждение
3.1 Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4
Клонирование гена полинуклеотидкиназы фага Т4 в вектор для экспрессии pET28-b проводили по общепринятой схеме. Полученный ПЦР-продукт обрабатывался эндонуклеазами Paq I и Xho I. Paq I (изошизомер BspH I) узнает сайт 5/-TCATGA-3/, внутри которого содержится АTG-кодон. Второй кодон гена начинается с аденина и в последовательности гена отсутствуют сайты для Paq I. Таким образом, удалось без каких-либо сложностей клонировать ген pseT в удобном положении относительно последовательности Шайн-Дальгарно. Индукция экспрессии гена Т4 полинуклеотидкиназы представлена на рисунке 7.
3.2 Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы
Клонирование генов ДНК-полимеразы, РНК-лигазы фага Т4 и Tth-полимеразы проводили с использованием эндонуклеаз рестрикции II-S типа.
Для достижения того же результата,