Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
, когда донор активируется. Но, когда в реакции мало акцепторов, активированный донор может диссоциировать с фермента [36,37,38].
Субстратная специфичность по отношению к молекуле донора в реакции аденилирования может быть определена невпрямую, а по всей реакции соединения. Рибонуклеозид 3/-5/-бифосфат может служить субстратом, тогда как 5/-нуклеозид монофосфат- нет, даже если последний имеет 5/-фосфат. Таким образом, по крайней мере остаток из одного нуклеотида и 3/-фосфат необходимы для того, чтобы служить донором. Второй фосфат должен быть на 3/-гидроксильном конце, т. к. рибонуклеозид 2/,5/-бифосфат не участвует в реакции. Сайт связывания донора, возможно, не выходит за пределы начального 5/-pNp района донора, т. к. скорость реакции с серией гомологичных доноров pAnp c одним и тем же акцептором почти одинакова.
ДНК может присоединяться в качестве донора, но для успешного осуществления реакции необходимо уменьшить температуру инкубации (ниже обычных 37o), увеличить количество фермента и увеличить время инкубации [39]. Донор такой же длины, что и ДНК ?Х174, может служить субстратом для РНК-лигазы.
Эффект нуклеотидного состава донора на скорость реакции: с пиримидиновыми pNp в 2-10 раз лучше, чем с их пуриновыми парами. Разрешаются модификации в сахаре, в основании и 5/-фосфате. В общем, оказывается, что чем больше основание в pNp, тем меньше реактивность в качестве субстрата, то есть эффективность донора : пиримидин > пурин > модифицированный пурин.
)Образование фосфодиэфирной связи. 3/-гидроксил молекулы акцептора вытесняет АМФ из активированного донора и образует фосфодиэфирную связь. Активированный донор, как выделенный из реакционной смеси с РНК-лигазой, так и синтезированный химически, взаимодействует с акцептором в отсутствии АТФ с образованием фосфодиэфирной связи и освобождением АМФ. Реакция освобождения АМФ координирована с образованием олигонуклеотидов. Один АМФ освобождается при образовании одной фосфодиэфирной связи.
Образование фосфодиэфирной связи продукта требует свободного от АТФ фермента. Добавление АТФ в реакцию изолированного аденилированного донора и акцептора уменьшает образование продукта. Предполагается, что аденилированный фермент неактивен в третьей реакции.
Тринуклеозид дифосфат-является олигонуклеотидом минимального размера, который может служить акцептором. Различные динуклеозид монофосфаты, например, GpG, UpI и pA2 могут быть присоединены к соответствующим донорам. Акцепторы, имеющие длину более трех остатков, не увеличивают выход реакции. Видимо, акцепторный сайт РНК-лигазы узнает 3 нуклеотида и 2 фосфата. В реакции могут участвовать молекулы, сравнимые по размерам с рибосомальной и вирусной РНК.
Обнаружена зависимость эффективности акцептора в реакции от крайнего основания в молекуле акцептора ("эффект крайнего основания"). "Лучшие" акцепторы- гомополимеры и олигомеры, содержащие адениновые остатки, тогда как акцепторы, содержащие С или U, и только U, являются "худшими". Видимо, из-за того, что тримеры UAG и AUG реже встречаются, чем AAG, фермент проявляет дискриминацию по отношению к уридиновым остаткам в любых трехнуклеотидных акцепторных сайтах. Для иллюстрации величины инактивирующего эффекта для уридиновых остатков приводится тот факт, что для добавления донора к U3 необходимо в 30 раз больше времени, чем в том же случае по отношению к А3 [31].
Больший эффект наблюдается при тестировании ДНК в качестве акцептора. С олигонуклеотидами dA4 реакция протекает в 200 раз медленнее, чем с rA4, при одинаковых молекулах донора. Для соединения ДНК пока невозможно добиться большей скорости, чем 2 превращения в час. Причина такой низкой активности ДНК неясна. Видимо, 2/-гидроксил косвенно вовлечен в реакцию. Добавление одного 3/-концевого рибонуклеотида к дезоксирибонуклеотиду увеличивает реактивность последнего, и наоборот, добавление дезоксирибонуклеотида к 3/-концу рибонуклеотидного акцептора делает его менее активным.
Двухцепочечные структуры часто ингибируют реакцию, катализируемую РНК-лигазой. В разных случаях получаются различные результаты. В одних случаях дуплексные структуры не могут связываться с донорным или акцепторным сайтом фермента, тогда как в других случаях связывание происходит без особых осложнений. Пока никакой ясной картины этого феномена не наблюдается.
В. Реакция циклизации (внутримолекулярная реакция).
Эту реакцию можно рассматривать как частный случай межмолекулярной реакции, в которой донор и акцептор являются частью одной молекулы. Так как. взаимодействие концов одной молекулы более вероятно, чем взаимодействие концов разных молекул, то внутримолекулярная реакция идет быстрей, с затратой меньшего количества фермента, по ставнению с межмолекулярной реакцией.
"Эффект крайнего основания" такой же, как и при межмолекулярной реакции.
Эффект длины. Кольцевые молекулы не могут образовываться, если они слишком коротки, или слишком длинны (низка вероятность взаимодействия концов олигорибонуклеотидов). Изучение этой проблемы позволило сделать вывод, что самым коротким олигомером в реакции может быть молекула из 8 нуклеотидов [31,36]. Скорость реакции увеличивается до максимальной при длине полимеров в 10-16 нуклеотидов, но при дальнейшем увеличении длины скорость реакции уменьшается. Аналогично для цепи ДНК: самым коротким олигомером может служить цепь из 6 остатков. Скорость наиболее высокая при 8-20 членном олигомере и низкая уже при длине в 30 оснований. Как и межмол