Geum.ru


Получение суперпродуцентов ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, РНК-лигазы, полинуклеотидкиназы фага Т4 и ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus HB8

Дипломная работа - Биология

Другие дипломы по предмету Биология



екулярная реакция, циклизация требует присутствия АТФ (именно dATФ!) [31].

Реакция циклизации является основой для определения активности фермента. Циклизация [5/-32P]олигоаденилата детектируется по устойчивости концевого фосфата с последующей обработкой щелочной фосфатазой.

Единица активности РНК-лигазы определяется как включение 1 нмоль олиго(А) в фосфатаз- устойчивую форму за 30 мин при 37 С [33].

С. Обратная реакция (Reversal of T4 RNA ligase)

Обратная реакция была обнаружена по появлению несоответствующих ожидаемым продуктам реакции. В работе [40] показали, что возможен обратный ход второй и третьей реакции. В итоге обратная реакция включает перенос 3/-концевого (например, pCp) остатка с одного олигомера на другой:

A3Cp + ACG A3 + ACGCp

Эта реакция стимулируется добавлением АМФ , но никаким другим 5/-нуклеозид дифосфатом. АТФ ингибирует обратную реакцию, т. к. образуется аденилированный фермент [31].

Не смотря на то, что не было сделано прямого сравнения, очевидно, что обратимость последних реакций синтеза олигомеров может происходить со скоростями, сравнимыми со скоростью прямой реакции. Это отличительная реакция РНК-лигазы фага Т4, в сравнении с Т4 ДНК лигазой, которая катализирует обратную реакцию с гораздо меньшей скоростью, чем прямую.

Обратная реакция может привести к трудностям при использовании РНК-лигазы в синтезе олигонуклеотидов.

Сравнение свойствТ4 РНК-лигазы с ДНК-лигазой фага Т4

Механизм реакции с РНК-лигазой аналогичен реакции, катализируемой Т4 ДНК лигазой [31]:

  1. В обоих случаях комплекс фермент-АМФ удерживается фосфоамидной связью.
  2. Оба фермента активируют 5/-фосфат донора с помощью переноса на него АМФ и образуя ангидридную связь.
  3. Третий шаг в реакции включает вытеснение АМФ и образование фосфодиэфирной связи в продукте реакции.
  4. РНК-лигаза предпочитает РНК-субстрат, тогда как ДНК-лигаза предпочитает соединять молекулы ДНК.

Биологическая роль продукта гена 63 фага Т4

РНК-лигазная активность детектируется через 3 минуты после инфекции клеток фагом, что позволяет рассматривать этот белок как ранний. В мутантах, дефектных по репликации ДНК, РНК-лигаза накапливается с различными другими ранними белками. Это указывает на то, что РНК-лигаза находится под контролем гена regA, который является посттранскрипционным репрессором ранних функций. Таким образом, можно предположить, что РНК-лигаза может быть необходима на ранних стадиях инфекции, возможно, в ДНК-репликации или в выключении клеток хозяина.

Продукт гена 63 является одним из белков, обеспечивающих сборку фага, но не входящих в состав фаговых частиц. Присоединение хвостовых нитей (TFA, tail fibre attachment) к базальной пластинке нековалентно, не требует АТФ и ионов Mg2+ , может происходить в отсутствии РНК-лигазы с низкой скоростью. Было показано, что продукт гена 63 появляется как на ранних, так и на поздних стадиях инфекции. Это подтверждает участие фермента в сборке вируcных частиц [31].

Установлено, что две активности РНК-лигазы не связаны между собой. Было показано, что несколько мутантов по гену 63, названных rli не имели РНК-лигазной активности, но нормально присоединяли хвостовые отростки [30,33,41]. В частности, один из амбер-мутантов (в С-концевой части белка) не имел РНК-лигазной активности, но обладал TFA-активностью [33].

Функция РНК-лигазы in vivo все еще остается неясной. Но можно сделать несколько предположений о биологической роли этого фермента:

  1. Возможно, что in vivo она участвует в репарации РНК или в предотвращении экзонуклеазного расщепления РНК (образованием кольцевого полирибонуклеотида) [30].
  2. Способность фермента соединять молекулы РНК указывает на возможность его участия в рекомбинации молекул РНК [30].
  3. Образование сополимеров РНК-ДНК может происходить in vivo
  4. РНК-лигаза- является продуктом гена 63, который может катализировать присоединение базальных пластинок фага Т4 при его сборке.
  5. Есть предположение, что РНК-лигаза больше участвует в метаболизме ДНК, нежели в РНК-процессинге [41].
  6. Есть версия, что РНК-лигаза участвует в процессинге т-РНК.

Видимо, РНК-лигаза является многофункциональным ферментом.

Применение РНК-лигазы фага Т4

  1. РНК-лигаза широко используется для синтеза олигорибонуклеотидов заданной последовательности оснований [31, 42]. При этом в качестве доноров используются олигонуклеотиды с блокированными 3/-концами, т. к. олигомеры с длиной больше, чем 8 оснований, могут участвовать во внутримолекулярной реакции, образуя циклические соединения . Разрешение проблемы -использование 3/-фосфорилированного донора или химическая модификация 2/- или 3/-гидроксильной группы концевого нуклеотида донора [42].
  2. Способность РНК-лигазы соединять одноцепочечные молекулы ДНК может использоваться для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов [43].
  3. С помощью РНК-лигазы можно производить радиоактивное мечение 3/-концов молекул РНК. В реакции используется [5/-32P]pNp в качестве донора и РНК как акцептор. Эта реакция получается аналогичной мечению 5/-конца цепи РНК in vitro с помощью полинуклеотидкиназы и [?32P]ATФ, и может быть использована в ситуации, когда 5/-концевое мечение невозможно [44].
  4. Получение модифицированных нуклеиновых кислот при использовании модифицированных pNp [31,44].
  5. Разработан метод амплификации фрагментов ДНК, содержащих последовательность определенного гена и примыкающую к нему 5/-некодирующую область (так называемый "заякоренный ПЦР"- anchored PCR). В данно