Geum.ru

«Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В. А. Алмазова Федерального агентства по оказанию высокотехнологичной медицинской помощи»

Вид материалаАвтореферат
2.2. Сравнительный анализ действия сердечных гликозидов и коменовой кислоты на рост эксплантатов различных тканей куриного эмбри
В концентрации
Подобный материал:
1   2   3   4   5   6

2.2. Сравнительный анализ действия сердечных гликозидов и коменовой кислоты на рост эксплантатов различных тканей куриного эмбриона


Для оценки участия Na+,K+-АТФазы в качестве трансдуктора сигнала в регуляции роста и развития клеток разных тканей в эмбриональный период онтогенеза использовали фармакологический анализ. В качестве фармакологических агентов были выбраны сердечные гликозиды: оуабаин, строфантин К и дигоксин.

В разных сериях опытов экспериментальными объектами были эксплантаты ткани сердца, спинальных ганглиев и сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов. Исследуемые ткани характеризуются наличием разных изоформ α-субъединицы Na+,K+-АТФазы, которые отличаются по чувствительности к сердечным гликозидам, в частности к оуабаину. Оуабаин был исследован в широком диапазоне концентраций от 10-8 М до 10-13 М. В опытах на эксплантатах ткани сердца 10-12-дневных куриных эмбрионов впервые выявлена эффективная концентрация оуабаина (10-10 М), сопоставимая с эндогенной, в которой гормон стимулировал пролиферацию кардиомиоцитов. Было доказано, что высокоаффинная к оуабаину α3-изоформа Na+,K+-АТФазы кардиомиоцитов участвует в регуляции кардиомоделирования. Оуабаин достоверно стимулировал рост эксплантатов исследуемой ткани на 33% в дозе 10-10 М. Прижизненно и на фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, было обнаружено, что зона роста экспериментальных и контрольных эксплантатов состоит из кардиомиоцитов и небольшого количества фибробластов. Наблюдалась спонтанная сократительная активность кардиомиоцитов.

Ранее было показано, что гликозид в концентрации 10-10 М на 50% ингибирует рост нейритов спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов (Пеннияйнен В.А и др., 2003). Оуабаин (10-10 М) практически не влиял на рост эксплантатов ткани сетчатки и недостоверно стимулировал их рост в концентрации 10-11 М и 10-12 М. Необходимо отметить, что эти концентрации гликозида не оказывали существенного влияния на рост нейритов сенсорных нейронов (Пеннияйнен В.А. и др., 2003) и эксплантатов ткани сердца. Впервые обнаружено, что в концентрации 10-13 М оуабаин достоверно стимулирует рост эксплантатов ткани сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов. Значение ИП экспериментальных эксплантатов превышало контрольное на 34%. Проведенные исследования показали, что в концентрации 10-8 М оуабаин полностью угнетал рост нейритов сенсорных нейронов, эксплантатов ткани сердца и сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов. Анализ полученных данных доказал, что действие оуабаина на рост исследуемых тканей является дозозависимым и тканеспецифичным. Гипотеза об участии Na+,K+-АТФазы в регуляции роста нейритов сенсорных нейронов, эксплантатов ткани сердца и сетчатки в эмбриональный период онтогенеза получила экспериментальное подтверждение. По-видимому, оуабаин в низких «эндогенных» концентрациях модулирует функцию трансдуктора сигнала, которую выполняет α3-изоформа α-субъединицы Na+,K+-АТФазы. Эта изоформа Na+,K+-АТФазы более чувствительна к оуабаину, чем 1-изоформа, активность которой оуабаин регулирует, начиная с концентрации 10-4 М (Dobretsov M.G. et al., 1999; Mathias R.T et al., 2000; Mobasheri A. et al., 2000). Эти данные получены авторами при работе с нейронами спинальных ганглиев взрослых крыс. Необходимо отметить, что гомология - и -субъединиц Na+,K+-АТФазы млекопитающих и птиц составляет 92-95% (Fambrough D.M, Bayane E.K, 1983). В качестве препаратов сравнения были использованы строфантин К и дигоксин. Исследования последних лет показали, что эндогенный дигоксин выделяется в системный кровоток из коры надпочечников в концентрациях, не затрагивающих активность ионного насоса (Goto A. et al., 1991; Kelly R.A., Smith T.W., 1992; Schoner W., Schiener-Bobis G., 2005). Функция эндогенного дигоксина пока не ясна, однако есть данные, указывающие, что его выделение провоцирует рост эндотелия сосудов (Aperia A., 2008).

В концентрации 10-6 М строфантин К практически полностью угнетал рост всех исследуемых тканей. В дозах 10-7 М и 10-8 М ингибирующее рост действие строфантина К было менее выражено. В концентрации 10-11 М строфантин К на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных нейронов практически не влиял и недостоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сетчатки. Впервые обнаружено, что строфантин К в концентрации 10-13 М вызывал достоверную стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов и почти не влиял на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных нейронов. Достоверное стимулирующее действие по отношению к эксплантатам ткани сердца препарат проявлял в концентрации 10-14 М и ниже. Таким образом, были обнаружены трофические свойства строфантина К. Действие препарата на рост эксплантатов исследуемых тканей, также как в случае с оуабаином, было дозозависимым и тканеспецифичным.

По отношению к ткани сердца дигоксин проявлял выраженное ингибирующее действие во всех исследуемых концентрациях. Дигоксин (10-6 М) почти полностью блокировал рост нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов сетчатки. При введении в питательную среду сердечного гликозида в концентрациях 10-7 М и 10-8 М наблюдали достоверное угнетающее рост исследуемых тканей действие. В концентрации 10-9 М дигоксин незначительно угнетал рост эксплантатов ткани сетчатки. Введение в питательную среду дигоксина (10-10 М) на рост эксплантатов не влияло. Впервые обнаружено, что дигоксин в концентрации 10-11 М достоверно стимулировал рост эксплантатов ткани сетчатки и практически не влиял на рост нейритов.

Результаты, полученные при изучении влияния строфантина К и дигоксина на рост эксплантатов ткани сердца, нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сетчатки, подтвердили предположение об участии Na+,K+-АТФазы в регуляции роста эксплантатов исследуемых тканей. Влияние сердечных гликозидов было тканеспецифичным и дозозависимым. Необходимо отметить, что используемые концентрации дигоксина, строфантина К и оуабаина сопоставимы с концентрациями эндогенных дигиталисоподобных факторов в плазме крови. Проведенные исследования показали, что эксплантаты ткани сердца, сенсорные нейроны и эксплантаты сетчатки 10-12-дневных куриных эмбрионов более чувствительны к оуабаину, чем строфантину К и дигоксину.

Результаты экспериментов также свидетельствовали о том, что Na+,K+-АТФаза (по-видимому, α3-изоформа ее α-субъединицы) оказывает тонкое регуляторное действие на рост и пролиферацию клеток исследуемых тканей в эмбриональный период онтогенеза, выполняя функцию трансдуктора сигнала.

В части экспериментов оценивали возможный механизм модуляции трансдукторной функции Nа+,К+-АТФазы молекулой оуабаина.

С помощью квантовохимических расчетов проведен полный конформационный анализ хелатных комплексов молекулы оуабаина с Са2+ в стехиометрии 1:1. В первом случае катион образует координационные связи с пятью атомами кислорода О1, О3, О5, О19 и О5’, захватывая атомы кислорода стероидного кольца и рамнозильного остатка. Во втором случае ион Ca2+ связан с тремя атомами кислорода О1, О11 и О19 стероидного кольца (Рогачевский И.В. и др., 2008). Возможность модуляции сигнальной функции Na+,K+-АТФазы комплексом оуабаин-Са исследовали в экспериментальных условиях на эксплантатах ткани сердца и спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов. Влияние хелатора ионов Ca2+ ЭГТА на рост эксплантатов ткани сердца и нейритов сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов оценивали в диапазоне концентраций от 10-2 М до 10-5 М. При введении в питательную среду ЭГТА в концентрации 10-3 М наблюдали достоверное угнетение степени роста, как эксплантатов ткани сердца, так и нейритов сенсорных ганглиев. ИП эксплантатов был ниже контрольного значения в среднем на 45,5%. При культивировании сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сердца в среде, содержащей ЭГТА (10-3 М) и оуабаин (10-8 М), наблюдали почти полное снятие ингибирующего действия оуабаина. ИП эксплантатов сенсорных ганглиев и ткани сердца незначительно отличался от контрольного значения. Стимулирующий эффект оуабаина (10-10 М) при культивировании эксплантатов ткани сердца в среде, содержащей оуабаин (10-10 М) и ЭГТА (10-3 М) также отсутствовал. ИП экспериментальных эксплантатов практически не отличался от контроля. Для того чтобы оценить вклад рамнозильного остатка молекулы оуабаина в способность гликозида модулировать сигнальную функцию Na+,K+-АТФазы в аналогичных экспериментальных условиях был исследован оуабагенин в концентрациях от 10-4 до 10-9 М. Гликозид регулировал рост эксплантатов ткани сердца и спинальных ганглиев дозозависимо. В концентрации 10-5 М оуабагенин достоверно угнетал рост нейритов сенсорных ганглиев и эксплантатов ткани сердца в среднем на 45% по отношению к контролю. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что чувствительность Na+,K+-АТФазы нейритов сенсорных нейронов (Пеннияйнен В.А. и др., 2003) и кардиомиоцитов к оуабагенину гораздо ниже, чем к оуабаину. Действие оуабагенина, в отличие от оуабаина, не было тканеспецифичным. Со структурно-химической точки зрения оуабагенин является агликоном оуабаина. Указанные молекулы различаются только присутствием рамнозильного остатка в положении 3β. Чувствительность аминокислотной последовательности Na+,K+-АТФазы рецептирующей сердечные гликозиды значительно повышается при наличии в атакующей молекуле рамнозильного остатка.

Отдельная часть работы была посвящена выявлению трофических и нейротрофических свойств производной гамма-пирона коменовой кислоты. Коменовую кислоту добавляли в питательную среду в диапазоне концентраций от 10-6 М до 10-10 М. Коменовая кислота (10-6 М) достоверно угнетала рост эксплантатов ткани сетчатки на 24%. На рост нейритов коменовая кислота в этой концентрации действия не оказывала. Влияние коменовой кислоты в концентрации 10-6 М на рост эксплантатов ткани сердца оказалось противоположным. В этой концентрации субстанция достоверно стимулировала рост эксплантатов ткани сердца на 40% по отношению к контролю. На фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, обнаружено, что в зоне роста присутствуют кардиомиоциты и небольшое количество фибробластов. В концентрации 10-7 М коменовая кислота угнетала рост эксплантатов ткани сетчатки незначительно, ИП эксплантатов был ниже контрольного значения на 17,5%. В этой дозе (10-7 М) субстанция достоверно стимулировала рост нейритов сенсорных нейронов. ИП был выше контрольного значения на 23%. Величина ИП эксплантатов ткани сердца в аналогичных условиях культивации была незначительно выше контрольного значения на 17% (p>0,05). Добавление в питательную среду коменовой кислоты в концентрации 10-8 М приводило к достоверной стимуляции роста эксплантатов ткани сетчатки и нейритов сенсорных нейронов на 18% и 81%, соответственно. Зона роста содержала нейриты сенсорных нейронов. На рост эксплантатов ткани сердца субстанция в этой концентрации влияния не оказывала. При введении в питательную среду коменовой кислоты в концентрации 10-10 М наблюдали достоверную стимуляцию роста эксплантатов ткани сетчатки. ИП был выше контрольного значения на 58%. На фиксированных препаратах в зоне роста присутствовали клетки пигментного эпителия сетчатки, палочки, колбочки, ганглиозные клетки. Рост нейритов сенсорных нейронов сохранялся на прежнем уровне. На рост эксплантатов ткани сердца препарат в этой концентрации не влиял. Проведенные исследования показали, что производная гамма пирона коменовая кислота обладает нейротрофическими и трофическими свойствами. Действие субстанции является дозозависимым и тканеспецифичным. Наибольшую тропность коменовая кислота, как и оуабаин, проявила в отношении регуляции роста эксплантатов ткани сетчатки.

В части экспериментов в питательную среду вместе с коменовой кислотой в эффективной для каждого вида ткани концентрации добавляли оуабаин (10-8 М). При культивировании эксплантатов исследуемых тканей в среде, содержащей коменовую кислоту в эффективной для каждой ткани концентрации и оуабаин (10-8 М), оказалось, что коменовая кислота устраняла ингибирующее действие оуабаина. ИП экспериментальных эксплантатов ничем не отличался от контрольного значения. Последнее свидетельствует о том, что коменовая кислота модулирует сигнальную функцию Nа+,К+-АТФазы не прямо, а опосредованно, через рецептор.

Дальнейшие исследования заключались в изучении фармакологической активности аноцептина – препарата, созданного на основе коменовой кислоты. Лекарственная форма аноцептина представляет собой 1% и 2% раствор для внутривенных инъекций, каждая ампула содержит 10 или 20 мг коменовой кислоты в 1 мл.