Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека 03. 01. 06. биотехнология

Вид материала

Содержание

Применение моноклональных антител в диагностике цитомегаловирусной инфекции

Подобный материал:

1 2 3 4 5 6 7

Выбор пар МКА для эффективного выявления антигена ВЗН

Оценку конкуренции МКА за эпитопы белка Е проводили в двухцентровом ИФА формата “сэндвич”. На очищенные для “захвата” АГ МКА, сорбированные на полистироловую поверхность микропланшета наносили вирусный препарат и затем вторые МКА меченные биотином (индикаторные). После отмывки выявляли связанную биотиновую метку конъюгатом стрептавидина с пероксидазой. Результаты представлены в табл. 12. Выявлено несколько пар МКА специфичных к удаленным друг от друга эпитопам и не конкурирующих между собой за места связывания с АГ: 9Е2+5Н6*; 9Е2+7G9*; 5H6+7G9*; 5H6+7E6*; 7E6+5H6*; 7E6+7G9* (звездочками обозначены индикаторные антитела). По результатам титрования АГ разными парами МКА, наиболее перспективной для использования в иммунохимических тестах представлялась пара МКА 9Е2+5Н6*, которая и была использована в дальнейших экспериментах.

Иммунохимическое выявление вируса Западного Нила в биопробах

С использованием пары МКА (9Е2 для захвата АГ и 5Н6, связанных с биотином для детекции и конъюгата стрептавидина с пероксидазой) исследован ряд вируссодержащих субстанций с целью оценки эффективности данных АТ для выявления АГ ВЗН. На рис. 19 представлены результаты выявления очищенного антигена и лизата инфицированных клеток. Очищенный АГ ВЗН (с концентрацией по белку 1 мг/мл) эта система достоверно определяет в разведении 1/51200. Таким образом, лимит выявления АГ составляет 1 - 2 нг/мл. Выбранная пара МКА позволяет выявлять в ростовой среде инфицированных клеток Vero вирусный АГ семи исследованных штаммов ВЗН, выделенных от разных хозяев – людей, птиц и нескольких видов клещей в разное время (рис. 20).

Для оценки эффективности обнаружения АГ ВЗН в биопробах от животных была моделирована ЛЗН (штамм Египет-101) на белых беспородных мышах при внурибрюшинном заражении, как описано Писаревым В.Б. и соавт. (2007). Биологический материал забирали в разгар заболевания (активность резко снижена, шерсть взъерошена, живот асцитный, паралич задних конечностей). Животным под эфирным наркозом проводили декапитацию и забор биологического материала проводили с соблюдением требований инструкций, разработанных для работы с вирусами II группы патогенности и правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Из крови получали сыворотку, а из органов готовили 10 %-е гомогенаты мозга, печени, селезенки, почек, легкого и сердца. В качестве положительного контроля на АГ использовали ростовую среду от инфицированных клеток Vero. Результаты представлены на рис. 21. По данным титрования было выявлено, что в цельной крови АГ практически не обнаруживается, а наибольшее его количество сконцентрировано в мозговой ткани и клетках печени. В клетках сердца, селезенки, почек и легкого мышей ВЗН так же продуктивно реплицируется, что говорит широком диапазоне его тропности.

На основании этих данных совместно с ЗАО “Вектор-Бест” была разработана экспериментальная тест-система “ВектоНил-антиген”. Для “захвата” АГ использовались иммобилизованные высокоспецифичные МКА 9Е2, а в качестве конъюгата применялись меченые пероксидазой хрена МКА 5Н6. Сотрудниками лаборатории ООИ ФГУЗ «ЦГиЭ в Волгоградской области» были проведены полевые испытания этой тест-системы. Результаты представлены в табл. 13. Было исследовано 264 пробы из внешней среды на наличие антигена АГ ВЗН, в том числе суспензии из органов 62-х птиц (видовой состав – грачи, вороны, дрозды), 114 комаров (рода Aedes, Culex, Anopheles); 36 клещей (виды H. Morginatum и D. Reticulatum), органов 52–х мелких мышевидных грызунов. Положительный результат на АГ был получен в 15 пробах (5,6 %): комаров – 14 (12,2 %) и клещей – 1 (2,7 %). Комары рода Aedes и Culex пойманы в Камышинском районе Волгоградской области и г. Волгограде. Клещ H. morginatum был снят с грача (Октябрьский район Волгоградской области).

Таким образом, разработанная на основе двух видов МКА, тест-система “ВектоНил-антиген”, может применяться при проведении эпидемиологических исследований на присутствие АГ ВЗН в биологических образцах, собранных в природе.

Таблица 12

Результаты оценки МКА, специфичных к разным эпитопам белка Е вируса Западного Нила методом двухцентрового ИФА в формате “сэндвич”

№	МКА захвата	Индикаторные МКА, меченные биотином
9Е2	5Н6	4D10	7E6	5F11	11G3	4F11	3F4	7G9
1	9Е2	0,23	3,83	0,56	0,84	0,66	0,06	0,78	0,60	2,51
2	5Н6	0,55	0,80	2,53	2,72	3,17	0,99	0,94	0,89	3,09
3	4D10	0,04	0,48	0,62	0,03	1.03	0,06	0,66	0,61	0,54
4	7E6	0,01	3,57	0,65	0,19	0,86	0,04	0,79	0,67	3,20
5	5F11	0,05	0,43	0,70	0,01	0,97	0,03	0,51	0,64	0,45
6	11G3	0,01	0,43	0,84	0,05	1,45	0,04	0,62	0,52	0,38
7	7B9	0,01	0,29	0,94	0,01	1,64	0,02	0,44	0,51	0,27
8	3A9	0,01	0,41	1,64	0,09	3,30	0,05	0,79	0,49	0,33
9	5F7	0,09	0,24	1,19	0,06	2,60	0,03	0,42	0,70	0,47
10	4F11	0,08	0,19	1,53	0,09	2,80	0,07	0,38	0,53	0,31
11	3F4	0,09	0,27	1,33	0,09	2,63	0,07	0,43	0,53	0,33
12	1B7	0,10	0,09	0,43	0,09	0,62	0,05	0,39	0,54	0,21
13	2G12	0,08	0,08	0,52	0,09	0,62	0,05	0,39	0,54	0,21
14	7G9	0,06	0,99	1,04	0,24	1,62	0,02	0,52	0,57	0,81
15	7B2	0,07	0,11	0,71	0,05	1,19	0,05	0,48	0,52	0,29
16	АС мыши*	0,16	1,49	1,50	0,79	2,71	0,21	0,67	0,62	1,88
17	контроли	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1	<0,1

Примечание: В качестве антигена использован лизат клеток Vero инфицированных ВЗН (штамм Eгипет-101); МКА для сорбции в ячейках планшета использовали в концентрации 10 мкг/мл; ндикаторные МКА использовали в концентрации 1 мкг/мл; жирным шрифтом выделены результаты для неконкурирующих МКА, т.е. активно “захватывающих” АГ; АС мыши* - сыворотка мыши, иммунизированной инфекционным вирусом. В качестве отрицательных контролей использовали лизат не инфицированных клеток Vero и очищенные препараты вирусов клещевого и японского энцефалитов.

Рис. 19. Результаты исследования серий двукратных разведений вирусных препаратов в двухцентровом ИФА с использованием пары МКА 9Е2 для захвата и 5Н6 для детекции

Рис. 20. Титрование антигена в вируссодержащей ростовой среде от инфицированных клеток Vero в двухцентровом ИФА парой МКА 9Е2 и 5Н6*

Примечания: стрелками обозначен диапазон чувствительности ИФА при сравнении инфекционного титра вируса в супернатантах при параллельном их титровании на культуре клеток Vero. Разведение супернтанта (-3) соответствует в данном эксперименте 100 ТЦД50/100 мкл; Eg -101 – штамм Египет 101, выделен в 1951г. в Египте из сыворотки больного ребенка; Hp-94 – штамм Ast63-94-ticks, выделен в 1963 г. из клещей Hyalomma marginatum в дельте Волги (Астраханская область); Vlg-27924 – штамм LEIV-VLG00-27924-human, выделен в 2000 г. в г. Волгограде из мозга человека 74 лет, погибшего от ЛЗН; А-72 – штамм LEIV-Az70-72-ticks, выделен в 1970 г. из клещей Ornithodoros capensis в Азербайджане; Vlg-27889 – штамм LEIV-VLG99-27889-human, выделен в 1999 г. в г. Волгограде из мозга человека 15 лет, погибшего от ЛЗН; А-1640 – штамм LEIV-Az67-1640-nuthatch, выделен в 1967 г. из мозга птицы Sitta europaea в Азербайджане; Tur-2914- штамм LEIV-Tur73-2914-ticks, выделен в 1973 г. из клещей Hyalomma detritum в Туркмении.

Рис. 21. Выявление вирусного антигена в биологических пробах от инфицированных мышей методом двухцентрового ИФА парой МКА 9Е2 и 5Н6*

1 - супернатант от инфицированных клеток Vero (положительный контроль); 2 – 10 %-й гомогенат мозговой ткани; 3 – 10 %-й гомогенат печени; 4 – 10 %-й гомогенат легкого; 5 – 10 %-й гомогенат селезенки; 6 – 10 %-й гомогенат cердца; 7 – 10 %-й гомогенат почек; 8 - цельная сыворотка крови; 9 - ростовая среда от клеток Vero (отрицательный контроль).

Таблица 13

Результаты полевого испытания ИФА тест-системы “ВектоНил-антиген”

Пробы	Количество исследованных проб	Результаты, полученные при использовании тест-системы “ВекторНил-антиген”
Положительных	Отрицательных
Суспензии из органов птиц (грачи, вороны, дрозды)	62	0	62
Суспензии из комаров родов Aedes, Culex, Anopheles	114	14	100
Cуспензии из органов мелких мышевидных грызунов	52	0	52
Суспензии из клещей H.morginatum, D.reticulatum	36	1	35
Всего	264	15	249

Примечания: для конструирования диагностической ИФА тест-системы”ВектоНил-антиген” для “захвата” антигена использовали очищенные МКА 9Е2; в качестве конъюгата применялись меченые пероксидазой хрена МКА 5Н6. Биологические образцы были собраны в очагах инфекции ЛЗН в Волгоградской области сотрудниками ООО ФГУЗ “ЦГ и Э в Волгоградской области”.

^ Применение моноклональных антител в диагностике цитомегаловирусной инфекции

Получение коллекции мышиных гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку рр65 вируса герпеса человека 5 типа (ВГЧ-5, ЦМВ)

Очищенные частицы ЦМВ содержат от 30 до 40 полипептидов с молекулярной массой в диапазоне 20 - 300 кДа (S. Landolfo et al., 2003). В матриксном (тегументном) слое вириона расположены, предположительно, 25 белков (W. Gibson, 1996). В связи сэтим, провести отбор гибридом, продуцирующих МКА к белку рр65, при иммунизации животных нативным АГ, достаточно проблематично.

Для иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов целенаправленно был использован рек. белок рр65, полученный в результате биосинтеза в клетках E.coli (И.М. Суслопаров и др., 2005). Исследование антигенных и иммуногенных свойств рек. белка рр65 не проводили, в связи с очевидностью этих характеристик. Ранее было описано применение кроличьих ПАТ, полученных к рек. белку рр65 для выявления продуктивной ЦМВИ в тканях сердца пациентов, после операции аортокоронарного шунтирования (М.А. Суслопаров и др., 2005). Кроме того, для формирования отечественной стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих АТ к ЦМВ человека, были использованы рек. белки - рр150, р52 и белок рр65 (С.Н. Ивченко, 2008).

В результате слияния и клонирования получены, тестированы и заложены на хранение в Банк гибридом ГНЦ ВБ “Вектор” (в жидком азоте) 11 гибридных клеточных линий, стабильно продуцирующих МКА, специфичных к рек. белку рр65.

Характеризация МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ЦМВ

Характеризацию АТ проводили методом ТИФА с использованием рек. белка и нативного вирусного АГ, полученного в виде лизата инфицированных клеток Vero. Определяли класс IgG, концентрацию АТ в очищенных препаратах и титры специфического взаимодействия с АГ. Результаты представлены в табл. 14. Все гибридные клетки продуцировали МКА класса IgG_1,. взаимодействовали в ТИФА с рек. белком в диапазоне разведений от 1/24300 до 1/1968000, а с нативным вирусным белком в диапазоне от 1/1600 до 1/25600 и выявляли оба белка в ИБ. Наибольшую активность при взаимодействовии с вирусным белком рр65 в ТИФА проявляли МКА 5F10.

Таблица 14

Характеристика МКА, специфичных к рекомбинантному белку рр65 ЦМВ

№ п/п	Название гибридомы и МКА	Класс IgG	Титры МКА в ТИФА (обратные величины) к антигенам*	Концентрация очищенных МКА (мг/мл)	Иммуноблоттинг с использованием антигенов**
Рекомби-нантному	Нативному	Рекомби-нантного	Нативного
1	5F10	IgG1	1968000	25600	10,3	+	+
2	1F9/H11	IgG1	1968000	12800	8,7	+	+
3	1F9/E8	IgG1	1968000	12800	7,25	+	+
4	I/A	IgG1	218700	12800	7,0	+	+
5	I/G	IgG1	24300	3200	5,3	+	+
6	I/C5	IgG1	24300	1600	4,0	+	+
7	I/H	IgG1	24300	3200	4,7	+	+
8	I/В10	IgG1	24300	3200	6,0	+	+
9	I/D4	IgG1	24300	3200	4,5	+	+
10	II/H10	IgG1	1968000	12800	7,6	+	+
11	II/C12	IgG1	1968000	12800	8,1	+	+

Примечание: * В ТИФА для сенсибилизации планшетов использовали рек. рр65 с концентрацией 1 мкг/мл, а нативный АГ (лизат инфицированных клеток Vero) в разведении 1/20. ** В ИБ рекомбинантный и нативный белки использовали в объемах по 10 и 20 мкл на дорожку, соответственно.

Выявление вирусного белка рр65 в клетках, инфицированных цитомегаловирусом человека

Для исследований ЦМВ человека используют, главным образом, диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека, так они переживают продуктивную инфекцию с характерным для этого вируса цитопатическим эффектом – округление, увеличение размеров, многоядерность (Н.Е. Федорова и др., 2005; Л.К. Эмралидзе и др., 2005). Было показано, что ЦМВ человека стимулирует клетки Vero к вступлению в фазу митоза. Инфицированные клетки Vero могут нормально завершать цикл деления, так как прирост числа клеток в этой популяции обычно не ниже уровня контрольных незараженных клеток. С помощью МКА показана экспрессия сверхраннего белка р72 ЦМВ в инфицированных клетках этого вида (Н.Е. Макарова, 1995).

Для оценки продуктивной ЦМВИ исследовали уровень синтеза белка рр65 в нескольких культурах клеток - L-68, Vero, RH и 293. Характерное ЦПД вируса (набухание и лизис) наблюдалось только на чувствительной культуре клеток L-68, остальные инфицированные культуры не отличались визуально от контрольных незараженных клеток. На рис. 22 приведены результаты ПААГ-ЭФ лизатов инфицированных клеток перечисленных выше культур.

Визуально белок рр65 в большом количестве присутствует во всех вирусных препаратах. Однако этот белок сложно отличить от сходного с ним по молекулярной массе бычьего сывороточного альбумина (БСА, 66 кДа), содержащегося в ростовой среде от инфицированных клеток. Отмывание клеточного монослоя при получении лизатов не обеспечивает полного избавления от этого белка. В связи с этим, далее наличие специфического АГ в лизатах оценивали методом ИБ. На рисунке 23 видно, что очищенные МКА 5F10 активно выявляют нативный вирусный белок рр65 в препаратах, полученных при инфицировании ЦМВ разных культур клеток – Vero, RH и L-68.

Растворы меркаптоэтанола и SDS, использующиеся при выполнении процедуры ЭФ могут вызывать нарушение структуры вирусных белков. Для оценки эффективности взаимодействия полученных МКА с нативными вирусными белками, выращивали инфицированную культуру клеток Vero в лунках 96-луночного культурального планшета и спустя 7 суток клетки фиксировали на поверхности планшета этанолом. Инфицированные клетки обрабатывали очищенными МКА и антивидовыми антителами, меченными пероксидазой. Окрашивание проводили с использованием субстрата на основе 3-amino-9-ethylcarbazole. Результаты иммуноцитохимического анализа приведены на рис. 24. Видно, что МКА 5F10, специфичные к рек. белку рр65, интенсивно окрашивают нативный вирусный белок рр65 в виде мелких и крупных конгламератов в персистентно инфицированных клетках Vero.

Результаты исследования в ТИФА серий двукратных разведений герпесвирусных АГ показали, что применение МКА 5F10 позволяет определять рек. белок рр65 в концентрации 2,5 нг/мл (на рис. 25). Вирусный АГ, приготовленный из лизата инфицированных клеток Vero, выявляется на порядок хуже, что пропорционально относительно небольшой доле целевого белка в общем массиве лизатных протеинов. В качестве отрицательных контролей в этих экспериментах использовали нативный ВПГ-2 (М.А. Суслопаров и др., 2004), так же приготовленный из лизата инфицированных клеток Vero, и рек. белок gG вируса ВПГ-2 (М.А. Суслопаров, 2009), который является типоспецифическим маркером для этого вируса. Исследованные МКА не вступали в перекрестные реакции ни с тем, ни с другим контрольным образцом, что свидетельствует об их типовой специфичности.

Проведенные эксперименты показали, что полученные МКА обладают высокой специфичностью и активностью, позволяющей эффективно применять их для ранней диагностики ЦМВИ.

К сожалению, отсутствие животной модели для ВГЧ–5 (ЦМВ) не позволяют исследовать протективное или лечебное действие полученных МКА. Но получение МКА может иметь потенциальное терапевтическое значение. Так как в настоящее время нет препаратов широкого антивирусного действия, идет активное исследование препаратов и подходов к лечению ЦМВИ. На том факте, что основной белок тегумента рр65 может самостоятельно доставляться из инфицированных клеток в ядра соседних клеток (S. Schmolke et al., 1995; С.С. Ряскина и др., 2006), может быть сконцентрирован подход антивирусной терапии против ЦМВИ. Есть данные о том, что рр65 оказывает негативное влияние на развитие интерферонового сигнала на начальных стадиях инфицирования после проникновения вируса в клетку, до начала синтеза остальных вирусных белков (E. Browne et al., 2003). Показан вакцинный потенциал белков ВГЧ-5, синтезированных альфавирусными репликонами, несущими гены белков IE1, gB и рр65 (E.A. Reap et al., 2007; M.R. Schleiss, 2008).

Рис. 22. Результаты электрофоретического

анализа белковых препаратов

1 – очищенный рек. белок рр65 (10 мкл);

2-5 - лизаты клеток Vero, RH, L68 и 293,

инфицированных ЦМВ (по 20 мкл на дорожку);

6 – препарат очищенных МКА 5F10 (1 мкл),

7 - белковые маркеры молекулярной массы (Bio-Rad).

Рис. 23 Результаты иммуноблоттинга белков ЦМВ в лизатах инфицированных клеток с применением

МКА 5F10, специфичных к рекомбинантному белку рр65

1,2,3 – Лизаты инфицированных ЦМВ клеток Vero, RH и L68,

соответственно (по 20 мкл на дорожку).

4 – Очищенный рек. белок рр65 (10 мкл)

(положительный контроль).

5 – Лизат клеток Vero, инфицированных вирусом простого герпеса 2 типа (отрицательный контроль).

6 - Значения молекулярной массы белковых маркеров.

МКА 5F10 использованы в разведении 1/500.

Рис. 24. Выявление белка рр65 в инфицированных клетках Vero иммуноцитохимическим окрашиванием с использованием МКА 5F10

Не инфицированная культура клеток Vero (отрицательный контроль).
Не инфицированная культура клеток Vero, обработанная МКА 5F10 (отрицательный контроль).
Инфицированная ЦМВ культура клеток Vero, последовательно обработанная МКА 5F10 и конъюгатом антивидовых антител с пероксидазой.

Рис. 25. Результаты ТИФА серии двукратных разведений антигенов герпесвирусов

Примечания: ВПГ-2 - вирус простого герпеса 2 типа (М.А. Суслопаров и др., 2004);

рек.gG – рек. белок gG ВПГ-2 (М.А. Суслопаров, 2009);

МКА 5F10 использованы в концентрации 2 мкг/мл.

Blog

Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека 03. 01. 06. биотехнология

Содержание