Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека 03. 01. 06. биотехнология

Вид материала

Содержание

Объем и структура работы
Содержание диссертации
AAGCTTTTACTTCTCAATCACAGCTGGAA – 3’ Для гена NP: 5’ – AAAAGGATCC
Результаты и их обсуждение

Подобный материал:

1 2 3 4 5 6 7

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 статей, входящих в список ВАК, 20 тезисов, получено 7 патентов на изобретение.

^ Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, главы литературного обзора, главы материалы и методы, 3-х глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на 336 cтр., включает 28 таблиц и 53 рисунка. Список литературы состоит из 753 источников, включая 132 отечественных работ.

^ Содержание диссертации

Материалы и методы исследований

В работе использовали вирус Марбург (ВМ) штамм Popp, концентрированный и очищенный методом ультрацентрифугирования плазмы крови инфицированных морских свинок (А.А. Букреев, и др., 1995) и инактивированный в течение 24 ч при 8-10⁰С добавлением 0,17 % димера этиленимина (ДЭИ) с дальнейшим прогреванием при 60⁰С в течение 1 часа (S. Mitchel et al., 1984). Вирус Эбола-Заир (ВЭ) штамм Mayinga, был сконцентрирован и очищен из суспензии инфицированной культуры клеток Vero, инактивировали кипячением в течение 2 мин в растворе, содержащем 5 % b-меркаптоэтанола и 1 % додецилсульфата натрия (SDS) с дальнейшим прогреванием при 60⁰С в течение 1 часа (А.А. Чепурнов, и др., 1994). Получение рекомбинантных (рек.) белков ВМ в результате экспрессии в прокариотической системе E. coli полноразмерных генов VP35, VP24, GP, NP описано (А.В. Сорокин и др., 1999; А.В. Качко и др., 2001) и препараты предоставлены авторами.

Семь штаммов вируса Западного Нила (ВЗН): LEIV-VLG99-27889-human; LEIV-VLG00-27924-human; LEIV-Tur73-2914-ticks; LEIV-Az70-72-ticks; LEIV-Az67-1640-nuthatch; Ast63-94-ticks; Eg101, полученные из коллекции вирусных препаратов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского, были пассированы на культуре клеток Vero и на новорожденных белых мышах заражением в мозг.

Сыворотка крови морских свинок, инфицированных ВЭ (референс-антисыворотка), получена из Белорусского НИИ ЭМ. Коммерческие препараты лошадиных IgG против инфекционных ВЭ и ВМ, очищенные спиртовым фракционированием по Кону (И.В. Борисевич и др., 1996), получены из ВЦ НИИМ МО РФ (г. Сергиев Посад). Получение сывороток против ВЭ и ВМ проводили иммунизацией мышей BALB/c (массой 18-20 г), крыс Lou (массой 180-200 г) инактивированными вирусными препаратами. Сыворотка крови кроликов, специфичная к ВМ, получена при иммунизации животных инактивированным вирусным препаратом. В качестве референс-антисывороток против ВМ использовали полученную из Белорусского НИИ ЭМ сыворотку крови инфицированных морских свинок и сыворотку крови сотрудника ГНЦ ВБ “Вектор”, переболевшего ГЛМ в результате случайного лабораторного заражения (В.В. Никифоров и др., 1994). Моносыворотки к отдельным рек. белкам филовирусов получали в результате 4-кратной (в течение месяца) иммунизации неинбредных мышей ICR в суммарной дозе - 100 мкг/мышь. Поликлональные сыворотки к ВЗН получали иммунизацией неинбредных мышей ICR и мышей BALB/c инфекционным вирусом и инактивированным вирусным препаратом. Все манипуляции с животными проводили с применением анестезии, в соответствии с ветеринарным законодательством.

Использовали культуры клеток: мышиную P3.NS.1/1-Ag4.1 (NS/1) и крысиную 210RC.Y3-Ag1.2.3 миеломы (полученные из Онкологического центра РАМН) культивировали на среде DMEM(M) (производство ГНЦ ВБ “Вектор”) с добавлением 10 % - 15 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (Flow Laboratories, Англия), 150 мг L – глутамина (ГНЦ ВБ “Вектор”) и 80 мг сульфата гентамицина (КРКА, Словения) на 500 мл среды; Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки), L-68 (диплоидные клетки легкого эмбриона человека), RH (клетки почки эмбриона человека) и 293 (клетки почки эмбриона человека) культивировали в среде DMEM(M) с 5 – 10 % ФБС. Иммунизацию мышей BALB/c - доноров иммунных спленоцитов проводили в течение двух недель по внутрилабораторной схеме (в общей дозе для ВМ - 98 мкг/мышь, ВЭ - 120 мкг/мышь; рек. белка рр65 - 220 мкг/мышь). Иммунизацию мышей ВЗН проводили по разным схемам, с использованием, как инактивированного препарата, так и инфекционного вируса (I.A. Razumov et al., 2005). Слияние клеток (гибридизацию) проводили с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 1300-1600) по методу, предложенному M.L. Gefter с соавт. (1977). Использовали соотношение миеломных клеток NS/1 к иммунным спленоцитам 1/3. Гибридные клетки выращивали при 37⁰C в атмосфере 7 %-го CO₂ и проводили селекцию в среде ГAT с 10^-5М аминоптерина (чтобы подавить рост клеток NS/1), гипоксантина и тимидина, с добавлением 10 % оптимизированной для гибридом фетальной сыворотки (HyСlone, США). Тестирование культуральной среды от гибридных клеток проводили методом твердофазного ИФА (ТИФА), используя полистирольные планшеты (производства ВНИИ Медполимер (Москва) или Costar (США), проявление проводили с использованием субстрата ОФД (1 мг/мл о-фенилендиамина в цитратно-фосфатном буферном растворе (0,2 М лимонной кислоты, 0,5 М Na₂HPO₃, рН 5,0) с 0,03 % Н₂О₂). Иммуно-химическую реакцию останавливали добавлением 1 N соляной кислоты, оптическую плотность субстратно-индикаторной смеси в лунках измеряли на спектрофотометре “Uniscan” (Финляндия) при длине волны 492 нм. Клоны подвергали криоконсервации в среде DMEM(M) с добавлением 40 % ФБС и 10 % диметилсульфоксида. Наработку препаративных количеств МКА проводили in vivo.

Очистку МКА из асцитических жидкостей проводили осаждением балластных белков каприловой кислотой (H. Bazin et al., 1990) с последующей преципитацией IgG в 50 %-м растворе сульфата аммония на 0,05 М фосфатно-солевом буферном растворе. Определение концентрации белка в полученных препаратах выполняли с использованием набора “Protein Assay Kit” (Bio-Rad, США) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 495 нм. Класс и подкласс МКА определяли методом иммунодиффузии по Уохтерлони с помощью набора мышиных моноспецифических антител (IСN, США) и методом ТИФА с использованием моноспецифических мышиных антител (АТ) (Sigma, США). Определение константы аффинности МКА проводили, используя метод параллельного титрования АТ известной начальной концентрации на сорбированном антигене в ТИФА (Д. Берзовски и др., 1989; А.М. Егоров и др., 1991). Биотинилирование очищенных МКА проводили по методу E.A. Bayer с соавт. (1980), используя Biotin N-hydroxysuccinimide ester FW 341,4 (Sigma, США). Для проведения двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” использовали высокосорбционные полистирольные планшеты (Testiks(США) или Nunc (Дания). В промежуточных этапах иммунохимической реакции лунки планшетов промывали трис-солевым буферным раствором с твином (ТСБ-Т, pH 7,4), содержащим 0,15 М NaCl, 0,02 M трис-HCl, 0,05 % твин-20. Проявление проводили с использованием жидкого субстрата ТМБ (3,3’,5,5’–Tetramethylbenzidine), останавливали реакцию добавлением 1 N соляной кислоты, оптическую плотность субстратно-индикаторной смеси в лунках измеряли на спектрофотометре “Uniscan” при длине волны 450 нм.

Фрагменты генома ВЭ, кодирующие белки NP и VP40 получены в ОТ-ПЦР реакции с использованием следующих праймеров:

Для гена VP40:

5’ – AAAAGGATCCATGAGGCGGGTTATATTGCCTAC – 3’

5’ – AAAA^ AAGCTTTTACTTCTCAATCACAGCTGGAA – 3’

Для гена NP:

5’ – AAAAGGATCCATGGATTCTCGTCCTCAGAAAATCTGG – 3’

5’ – AAAAAAGCTTTCACTGATGATGTTGCAGGATTG-3’

Полноразмерные копии генов VP40 и NP ВЭ после гидролиза эндонуклеазами BamHI и HindIII клонированы в плазмиду pQE-30 (QIAGEN). Для сборки полноразмерной ДНК-копии гена белка VP40 ВМ использовали библиотеку клонов Е. coli (штамм JC5183), несущих рекомбинантные плазмиды pQE31 со вставками ДНК-копий фрагментов геномной РНК ВМ (A. Bukreyev et al., 1995).

Очистку рек. белков из лизата Е. coli проводили аффинной хроматографией на Ni-хелатной смоле (что обеспечивалось наличием в их составе полигистидинового белка 6хHis-tag), согласно протоколу фирмы-производителя (QIAGEN, Германия). Концентрацию белков измеряли при помощи набора “Bio-Rad Protein Assay Kit” в соответствии с рекомендациями производителя, используя в качестве стандарта овальбумин в 4 М мочевине. Электрофорез (ЭФ) вирусных препаратов, рек. белков и МКА проводили по методу, предложенному А.А. Остерманом (1981) в прерывистой буферной системе, с использованием 12-15 %-го полиакриламидного геля (ПААГ) с 0,1 % SDS в трис-глициновом буферном растворе в режиме 10 В/см. Окраску гелей проводили при помощи Кумасси G-250.

Иммуноблоттинг (ИБ) проводили после переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США) по методу H. Towbin и соавт. (1979) на аппарате Transphor (“LKB”, Швеция) в течение 1,5 часов при напряжении 80 В в 0,025 М трис-HCl буферном растворе, содержащем 0,192 М глицина (рН 8,3) и 20 % этанола.

^ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Применение МКА и рекомбинантных антигенов для разработки иммунодиагностики геморрагических лихорадок Марбург и Эбола

Описанные в литературе МКА, полученные к инактивированному разными способами ВМ (штамм Musoke), имеют разный состав и разную специфику. Семнадцать видов МКА к GP, 4 к NP, 2 к VP30 и один вид МКА к белку VP40 ВМ, инактивированного γ-облучением описано в работе (M. Hevey et al., 1997). Две гибридомы продуцирующие МКА к структурному GP ВМ (штамм Рорр), инактивированному 0,05 % формалином, содержит коллекция (C.В. Ручко и др., 2001). МКА, специфичные к определенным эпитопам рек. NP ВМ (штамм Musoke), были использованы при конструировании ИФА тест-системы для установления быстрого диагноза ГЛМ (M. Saijo et al., 2005). Специфичные к ВЭ МКА получены, в основном, к рек. белкам GP и NP (J.A. Wilson et al., 2000; M. Niikura et al., 2001; A. Takada et al., 2001; J.S. Yu et al., 2006; S. Shahhosseini еt al., 2007).

Получение гибридом, продуцирующих МКА к вирусам Марбург (ВМ) и Эбола (ВЭ)

В результате 11-ти гибридизаций было получено более 2500 гибридных клеточных линии, растущих на селективной среде ГАТ. Выявление растущих гибридом осуществляли визуально, методом световой микроскопии. По результатам ТИФА ростовой среды от гибридом отбирали клеточные линии, продуцирующие специфичные МКА. С целью стабилизации культуральных свойств гибридом и секреции ими специфических IgG было проведено клонирование гибридных клеток методом предельных разведений. В результате отбора, после трех-кратного тестирования были получены коллекции, состоящие из 20-ти гибридомных клеточных линий, стабильно секретирующих МКА к ВМ (Е.И. Казачинская, 2002) и 39-ти гибридомных клеточных линий, стабильно секретирующих МКА к ВЭ. Клеточные линии были размножены, наработаны в культуральных сосудах и заморожены в жидком азоте (при минус 196 ⁰С).

Препараты очищенных МКА получали из культуральной среды гибридом и асцитических жидкостей мышей BALB/c и крыс Lou. Для характеризации МКА были определены: субклассы моноклональных IgG; белки вирусов, с которыми они взаимодействуют; титры специфического взаимодействия АТ с вирусным препаратам; количественный уровень синтеза гибридомных IgG в организме животных; константы аффинности.

Данные по иммуно-химическим свойствам МКА, специфичных к ВЭ представлены в табл. 1 (первая коллекция) и табл. 2 (вторая коллекция). Все гибридомные IgG по результатам типирования были отнесены к классу IgG разных подклассов. Уровень синтеза моноклональных IgG в организме мышей и крыс оценивали по концентрации белка в очищенных препаратах, которая составила от 0,5 до 14,5 мг/мл. Аффинность каждого МКА определяли методом ТИФА при параллельном титровании АТ (в одинаковой начальной концентрации 1 мг/мл) на инактивированном АГ ВЭ. Константы аффинности для каждого МКА находятся в диапазоне от 0,7 до 3,1х10⁸М^-1, а самое высокое сродство к вирусному антигену было определено для МКА 4В9 9,0х10⁸М^-1(см. табл. 1), специфичных к NP. Методом ТИФА было проведено определение специфичности взаимодействия вирусного FU с МКА, в виде культуральной и асцитической жидкости, а так же очищенных препаратов. Титры гибридомных АТ в асцитической жидкости находились в диапазоне разведений от 1/2700 до 1/6561000. В результате исследований методом ИБ было показано, что из 14 видов МКА первой коллекции - двенадцать специфичны к NP и два вида МКА к белку VP35 ВЭ (см. табл. 1). МКА, продуцируемые гибридомами второй коллекции, в основном специфичны к матриксному белку VP40 и 2 МКА специфичны к NP (см. табл. 2). Аффинность МКА второй коллекции не определяли в виду отсутствия достаточного количества инактивированного вирусного АГ.

Результаты по преобладанию в нашей коллекции МКА, специфичных к матриксному VP40 филовирусов, совпадают с данными авторов (A. Lucht et al., 2000), описавших коллекцию из 12 гибридных клеточных линий, девять из которых синтезируют МКА к VP40 инактивированного ВЭ-Заир.

Исследование специфичности полученных МКА указывают на возможность их использования как для анализа антигенной структуры филовирусных белков, так и для конструирования диагностических тест – систем для выявления антигенов ВМ и ВЭ.

Таблица 1

Свойства МКА (первая коллекция), специфичных к вирусу Эбола

№ п/п	Назва-ние гибри-домы и МКА	Класс IgG	Белок-ми-шень в ИБ	Титры МКА против ВЭ в ТИФА (обр. величины)	Концент-рация очищен-ных IgG (мг/мл)	Константа аффин- ности К_а, М^-1
Культу-ральная среда	Асцити-ческая жидкость	Очищенный препарат МКА
1	10A8	IgG2b	NP	900	218700	218700	7,2	1,4 x10⁸
2	1E5	IgG2b	NP	2700	218700	218700	6,3	2,5 x10⁸
3	4A8	IgG2b	NP	8100	2187000	2187000	8,0	2,8 x10⁸
4	10B4	IgG2a	NP	8100	2187000	2187000	9,0	2,5 x10⁸
5	7E1	IgG2a	NP	300	24300	24300	3,1	2,5 x10⁸
6	6G8	IgG2a	NP	300	8100	24300	6,8	0,7 x10⁸
7	4B9	IgG2b	NP	8100	656100	656100	7,4	9,0 x10⁸
8	2H9	IgG1	NP	900	72900	72900	6,0	2,5 x10⁸
9	6A8	н.о.	NP	900	27000	72900	4,3	2,9 x10⁸
10	9G11	IgG2a	NP	8100	2187000	2187000	6,0	2,5 x10⁸
11	9A7	IgG2b	NP	900	24300	24300	4,3	1,7 x10⁸
12	1C7	IgG2a	VP35	8100	729000	2187000	7,8	3,1 x10⁸
13	6F7	IgG2a	VP35	8100	656100	729000	8,3	2,8 x10⁸
14	7B11*	н.о.	NP	н.о.	512000	512000	7,2	н.о.

Примечания: МКА 7B11* - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения

(автор А.В. Перебоев).

Выявление иммунодоминатных белков вирусов Марбург и Эбола

Полученные гибридные клеточные линии продуцируют МКА, для которых белки-мишени определены: к белку VP35 - 7 линий, к VP40 - 20 линий и к NP - 16 линий (см. табл. 1, 2). Эти результаты показывают наличие антигенной структуры на внутренних белках VP35, VP40 и NP инактивированных вирионов ВМ и ВЭ. Вклад каждого белка в иммуногенность вирусного препарата по количеству полученных видов МКА оценить сложно, так как отбор положительных гибридом (продуцирующих МКА) проводили эмпирически, отбирая их в ТИФА по результатам сигнала ОП (>1,0) субстратно-индикаторной смеси в лунках с тестируемой культуральной средой от растущих гибридных клонов. Белок-мишень для полученных МКА можно определить, имея не менее 1 мл культуральной среды и достаточно АГ для переноса на нитроцеллюлозную мембрану, чтобы протестировать большое количество гибридных клонов, но это рутиная и затратная процедура.

Таблица 2

Свойства МКА (вторая коллекция), специфичных к вирусу Эбола

№ п/п	Название гибридомы и МКА	Cпеци-фичность к АГ	Класс IgG	Белок-мишень в ИБ	Титры МКА против ВЭ в ТИФА (обр.величины)	Концент- рация очищен- ных IgG (мг/мл)
Куль-туральная среда	Асцити-ческая жидкость	Очищен-ный препарат МКА
1	4A2	ВЭ-IS	IgG1	VP40	24300	6561000	6561000	7,7
2	5C10/H5	ВЭ-IS	IgG1	VP40	8100	72900	24300	6,3
3	3F6/E9/H8	ВЭ-IS	н.о.	VP40	900	24300	24300	4,3
4	2E12	ВЭ-IS	IgG2a	VP40	300	8100	8100	4,1
5	2G9/E12	ВЭ-IS	н.о.	VP40	900	24300	24300	2,5
6	2A3/C6	ВЭ-IS	н.о.	VP40	100	8100	н.о.	1,2
7	3E3/D8	ВЭ-IS	н.о.	VP40	100	2700	н.о.	0,5
8	4C4/E11/G12	ВЭ-IS	н.о.	VP40	900	24300	8100	2,8
9	3C7/D9	ВЭ-IS	IgG1	VP40	300	24300	24300	6,5
10	1B2	ВЭ-IS	IgG1	NP	8100	6561000	2187000	8,9
11	1B1	ВЭ-IS	н.о.	NP	100	8100	н.о.	н.о.
12	3B12	ВЭ-IS	н.о.	VP40	100	8100	н.о.	н.о.
13	4G8	ВЭ-IS	н.о.	VP40	300	8100	н.о.	н.о.
14	2H5	ВЭ-IS	н.о.	VP40	100	8100	н.о.	н.о.
15	1C1	ВЭ-8МС	IgG1	VP40	8100	6561000	6561000	14,5
16	1E6/A3	ВЭ-8МС	IgG1	VP40	8100	729000	729000	1,5
17	1B5	ВЭ-8МС	IgG2a	VP40	8100	218700	72900	5,7
18	3D9/C2	ВЭ-8МС	IgM	VP40	8100	729000	729000	7,0
19	3C12/G2	ВЭ-8МС	IgG2a	VP40	900	72900	72900	3,5
20	1G4	ВЭ-8МС	н.о.	VP40	300	н.о.	н.о.	н.о.
21	2H4	ВЭ-8МС	н.о.	VP40	100	н.о.	н.о.	н.о.
22	3F8	ВЭ-8МС	н.о.	н.о.	100	н.о.	н.о.	н.о.
23	3F6	ВЭ-8МС	н.о.	VP40	100	н.о.	н.о.	н.о.
24	7D12	ВЭ-8МС	н.о.	н.о.	100	н.о.	н.о.	н.о.
25	6A12	ВЭ-8МС	н.о.	н.о.	100	н.о.	н.о.	н.о.

Blog

Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека 03. 01. 06. биотехнология

Содержание