Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека 03. 01. 06. биотехнология

Вид материала

Автореферат

Содержание E.coli 1 – лизат E.coli

Подобный материал:

• Лабораторные методы исследования в диагностике аллергий, 15.05kb.
• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 357.26kb.
• Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
• Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым, 271.22kb.
• Сэндвич-метод иммуноферментного определения hbsAg с помощью рн чувствительных сорбируемых, 291.42kb.
• Отдаленные результаты применения моноклональных анти-ige антител в комплексной терапии, 508.34kb.
• Вопросы к зачету по дисциплине «Биотехнология», 68.5kb.
• Транспортные аварии, 102.46kb.
• Высокомолекулярные азотосодержащие органические вещества, молекулы которых построены, 51.51kb.
• Тема обмен белков. Вопросы лекции, 90.92kb.

Примечания: н.о. – не определяли; ВЭ-IS – исходный штамм ВЭ-Заир; 8МС – штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (V.E. Volchkov et al., 2000).


Кроме того, для иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов были использованы инактивированные вирусные АГ, что могло повлиять на антигенную структуру вирусных белков.

Исследование антигенного состава любого патогена необходимо для совершенствования дифференцирующей диагностики на специфические маркеры, а также для разработки эффективных вакцин и противовирусных препаратов. По литературны данным, основными белками филовирусов, вызывающими иммунный ответ организма, являются NP, VP40 и белок VP35. Это было выявлено методом ИБ при исследовании сывороток крови обезьян различных пород из возможного ареала распространения филовирусов и cывороток крови реконвалесцентов (S. Becker et al., 1992).

Исследование спектра АТ, продуцируемых организмом в ответ на иммунизацию или инфицирование животных ВМ и ВЭ проводили методом ИБ. В инактивированных вирусных препаратах были выявлены вирусные белки-иммуногены, взаимодействующие с АТ сывороток крови от иммунизированных и инфицированных животных (табл. 3). Это белки - GP, NP, VP40, VP35, VP30 и VP24, формирующие антигенную структуру филовирусного вириона и распознаваемые иммунной системой макроорганизма при инфицировании или иммунизации. Белки NP, VP40, VP35 ВМ выявлялись АТ исследуемых сывороток в виде мажорных полос. Эти результаты свидетельствуют, что белки инактивированных вирусных АГ не теряют своих иммуногенных свойств, то есть сохраняются антигенные детерминанты. Особый интерес для данного исследования представляют результаты взаимодействия белков инактивированных вирусов с АТ инфицированных морских свинок, с IgG лошадей и АТ сыворотки реконвалесцента (В.В. Никифоров и др., 1994).

У морских свинок, переболевших экспериментальной ГЛМ, несмотря на одинаковую дозу заражения и одинаковое количество прошедших суток на день взятия крови, варьировал титр АТ и диапазон специфичности к вирусным белкам. Тем не менее, доминирующие полосы при ИБ соответствовали белкам - NP, VP40 и VP35 (см. табл. 3). В ТИФА был обнаружен титр 1/218700 для препарата IgG лошадей. Особенность получения данных препаратов состоит в том, что лошади не восприимчивы к филовирусным инфекциям, но вырабатывают нейтрализующие АТ в титре 1/2048. По данным И.В. Борисевич и соавт. (2008) введение морским свинкам, полученного таким образом препарата, через 1 - 2 часов после заражения ВМ в дозе 20-50 ЛД50, защищало от гибели 88-100 % животных.

Противовирусные АТ сыворотки крови реконвалесцента выявляют эти белки в вирусном препарате методом ИБ так же в виде мажорных полос (см. табл. 3, рис. 1), что говорит о том, что внутренние структурные белки ВМ, так же как и наружные, презентируются иммунной системе организма индивидуально, обладают высокой иммуногенностью как в нативном, так и в инактивированном состоянии. Титр антивирусных АТ в сыворотке крови реконвалесцента составлял 1/24300. Такой же уровень антител наблюдался в сыворотке крови мышей (№ 2), иммунизированных инактивированным ВМ.

Так же в табл. 3 представлены результаты специфического взаимодействия в ТИФА белков ВЭ с противовирусными АТ. Наиболее высокий титр АТ (1/2187000 и 1/729000) был выявлен в сыворотках крови мышей (от гибридизаций № 5 и № 4), иммунизированных инактивированным АГ ВЭ.

Несмотря на то что, ВМ и ВЭ являются представителями одного семейства, по антигенной характеристике они имеют заметные отличия. На это обратили внимание K.M. Johnson соавт. (1977), пытаясь сравнить впервые выделенный ВЭ с уже известным ВМ. Дальнейшие исследования филовирусов подтвердили их антигенные различия (M.P. Kiley, 1988; E.D. Johnson et al., 1996). Но в работе S. Becker cоавт. (1992) отмечается, что при исследовании сывороток крови от людей, переболевших ГЛМ в 1967 г., регулярно наблюдалась кросс-реактивность с АГ ВЭ в реакции иммунофлюоресценции. Аминокислотная последовательность, определенная для NP ВМ и ВЭ, показывает высокую степень их гомологии 400 N-концевых а.о. (A. Sanchez et al., 1993), что позволяет предположить наличие антигенного перекреста. При сравнении аминокислотной последовательности белков VP35 ВЭ и ВМ также были обнаружены у них гомологичные участки (A. Bukreyev et al., 1993).

В исследовании было обнаружено, что в сыворотках крови животных ПАТ имеют перекрестную активность с гетерологичными антигенами в ТИФА (см. табл. 3). Методом ИБ ранее были показаны белки для перекрестных взаимодействий ПАТ мышей, иммунизированных ВЭ – это NP и VP35 ВМ (Е.И. Казачинская, 2002). Возможно, что при инактивации вирионов открылись гомологичные а.о. последовательности филовирусных белков.

Для исключения не специфического взаимодействия противовирусных АТ с гетерологичными вирусными белками использовали для исследования аффинно-очищенные рек. белки, полученные в результате экспрессии полноразмерных филовирусных генов в клетках E.coli.


Получение рекомбинантных белков филовирусов в экспрессионной системе E.coli и исследование их свойств с помощью противовирусных антител

Для наработки и очистки филовирусов необходим 4 уровень биозащиты, персонал со специальной подготовкой и надежная инактивация вирусных препаратов. Есть данные, что рек. NP ВЭ и ВМ, экспрессированные в виде полноразмерных копий в бакуловирусной системе и в виде С-концевых фрагментов в E.coli, обладали антигенностью и были использованы в ИФА в качестве АГ для обнаружения IgG в сыворотках реконвалесцентов. Специфичность определения IgG была 100 %-ной, без ложноположительных результатов. Кроме того, было обнаружено, что рек. NP ВЭ, полученный на основе гена NP ВЭ-Заир, можно использовать для выявления IgG к другим штаммам ВЭ - Судан, Рестон и Берег Слоновой Кости (M. Saijo et al., 2001). Рек. VP40 ВЭ использовали в качестве положительного контроля на АГ в лабораторной тест-системе (G. Kallstrom et al., 2005). Так же рек. VP40 ВЭ был использован в ИБ для точного определения специфичности МКА, полученных к инактивированному ВЭ-Заир (штамм Mayinga) (A. Luch et al., 2003).


Таблица 3

Исследование спектра филовирусных белков-иммуногенов и перекрестного взаимодействия поликлональных антител с филовирусными антигенами в ТИФА

Источник антител	Сутки взятия крови от начала иммуниза-ции	Иммуноген	Титры антител в ИФА (обратные величины)	Белки-иммуногены, выявляемые в ИБ на гомологичном инактивированном антигене
Антигены
инакт. ВМ	инакт. ВЭ
мышь № 1	14	инакт. ВМ	8100	<100	NP, VP35, VP40
мышь № 2	21	инакт. ВМ	24300	300	GP, NP, VP35, VP40,VP30,VP24
кролик	нет данных	инакт. ВМ	24300	<100	NP, VP40, VP35, VP30,VP24
IgG лошади	нет данных	инф. ВМ	218700	<100	GP, NP, VP35, VP40,VP30
ЧС	нет данных	инф. ВМ	24300	900	GP, NP, VP35, VP40,VP30,VP24
морская свинка	нет данных	инакт. ВМ	900	<100	NP, VP40, VP35
морская свинка* (6.4; 7.2)	14	инф. ВМ	200; 200		NP
морская свинка* (2.2; 4.2;6,3)	14	инф. ВМ	6400; 6400; 12800		GP, NP, VP40, VP35
морская свинка* (2.1;4.1;5.1; 6.1; 6.2)	14	инф. ВМ	1600; 800; 800; 400; 6400	<100	NP, VP40, VP35
морская свинка* (1.2;5.2)	14	инф. ВМ	400; 400	<100	NP, VP35
морская свинка* (1.3; 1.4)	14	инф. ВМ	400; 400	<100	NP, VP40
морская свинка* (3.1)	14	инф. ВМ	200	<100	VP40
мышь № 1	14	инакт. ВЭ-IS	2700	72900	NP, VP40, VP35,VP30, VP24
мышь № 2	14	инакт. ВЭ-IS	900	72900	NP, VP40, VP35,VP30, VP24
мышь № 3	14	инакт. ВЭ-IS	300	81000	L,GP, NP, P40,VP35,VP30,VP24
мышь № 4	21	инакт. ВЭ-IS	300	729000	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 5	14	инакт. ВЭ-IS	300	2187000	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 6	14	инакт. ВЭ-8МС	<100	9000	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 7	14	инакт. ВЭ-8МС	300	243000	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 8	14	инакт. ВЭ-8МС	300	72900	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 9	14	инакт. ВЭ-8МС	300	72900	L,GP,NP,VP40,VP35,VP30,VP24
кролик	нет данных	инакт. ВЭ-IS	2700	72900	NP, VP40, VP35,VP30, VP24
крыса	14	инакт. ВЭ-IS	8100	72900	NP
IgG лошади	26-42	инф. ВЭ	24300	218700	NP, VP40, VP35
морская свинка	нет данных	инакт. ВЭ-IS	<100	900	NP
морская свинка	нет данных	инф.ВЭ	<100	900	GP, NP
контроли	без антигена	<100	<100	-

Примечание к табл. 3: инакт. – инактивированный вирусный препарат; инф. – инфекционный вирус; ^*- сыворотки от выживших морских свинок, инфицированных ВМ (условное обозначение каждого животного); ЧС - сыворотка реконвалесцента (человек переболел ГЛМ) (Никифоров В.В. и др., 1994); нормальные сыворотки - мыши, кролика, крысы, лошади, морской свинки и человека использовались в качестве отрицательного контроля; № 1 - 9 – сыворотки мышей, представляющие собой каждая пул сывороток от 3 мышей – доноров иммунных спленоцитов, используемых для гибридизаций; NP, VP40, VP35 – жирным шрифтом выделены белки, образующие доминирующие полосы при ИБ.

Рис. 1. Иммуноблоттинг. Выявление белков вируса Марбург антителами сыворотки реконвалесцента 1 – нормальная сыворотка человека в разведении 1/1000; 2 – сыворотка человека, переболевшего ГЛМ (Никифоров В.В. и др., 1994), в разведении 1/1000; Стрелками обозначено местоположение белков ВМ на нитроцеллюлозной мембране.

Оценку степени чистоты рек. белков, полученных в настоящем исследовании оценивали по результатам ПААГ-ЭФ с SDS (рис. 2, 3, 4). Были исследованы свойства рек. белков ВМ и ВЭ: антигенные - по выявлению специфических антивирусных АТ реконвалесцента и АТ иммунизированных животных; и иммуногенные – по взаимодействию АТ, полученных к рек. белкам, с вирусными АГ методами ТИФА и ИБ. Серопозитивная сыворотка крови рековалесцента оказалась ценным препаратом для исследования рек. белков, так как содержит противовирусные АТ, которые наглядно отражают распознавание антигенных детерминант ВМ иммунной системой человека в течение естественной инфекции. Результаты тестирования, представленные в табл. 4 и табл. 5 демонстрируют, что рек. аналоги вирусных белков GP, NP, VP35, VP40,VP24 ВМ и VP35, NP, VP40 ВЭ обладают иммуногенностью - вызывают синтез антител в организме иммунизированных беспородных мышей и выявляют в ТИФА антивирусные антитела, то есть обладают антигенными свойствами.

Рис. 2. Электрофореграмма. Анализ белков, синтезирующихся под контролем рекомбинантной плазмиды pQE-VP35 вируса Эбола в клетках ^ E.coli 1 – лизат E.coli – pQE; 2,3 – лизат E.coli – pQE-VP35 ВЭ; 4 – препарат очищенного рек. белка VP35 ВЭ; 5 – препарат инактивированного ВЭ (стрелкой показан вирусный белок VP35); обозначено местоположение маркеров молекулярной массы – 18, 29, 36, 43, 68, 97 и 116, соответственно.

Рис. 3. Электрофореграмма вирусов Марбург и Эбола и очищенных рекомбинантных белков VP40

1. 
   Рек. белок VP40 ВМ (5 мкл);
   
2. препарат инактивированного ВМ (10 мкл);
   
3. препарат инактивированного ВЭ (10 мкл);
   
4. рекомбинантный белок VP40 ВЭ (5 мкл);
   
5. местоположение белковых маркеров молекулярной массы (Bio-Rad).
   

Рис. 4. Электрофореграмма вируса Эбола и очищенного рекомбинантного нуклеопротеина рекомбинантный белок NP ВЭ (5 мкл); препарат инактивированного ВЭ (10 мкл).