Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека 03. 01. 06. биотехнология
| Вид материала | Автореферат |
СодержаниеE.coli; 6 – лизат клеток E.coli E.coli, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль); 8 - лизат E.coli |
- Лабораторные методы исследования в диагностике аллергий, 15.05kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 357.26kb.
- Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
- Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым, 271.22kb.
- Сэндвич-метод иммуноферментного определения hbsAg с помощью рн чувствительных сорбируемых, 291.42kb.
- Отдаленные результаты применения моноклональных анти-ige антител в комплексной терапии, 508.34kb.
- Вопросы к зачету по дисциплине «Биотехнология», 68.5kb.
- Транспортные аварии, 102.46kb.
- Высокомолекулярные азотосодержащие органические вещества, молекулы которых построены, 51.51kb.
- Тема обмен белков. Вопросы лекции, 90.92kb.
Таблица 4
Исследование антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса Марбург
| № п/п | ПАТ | Взаимодействие ПАТ с ВМ и рекомбинантными белками в ИБ | Титры рекомбинантных белков при специфическом взаимодействии с ПАТ (обратные величины) в ТИФА | |||||||||
| ВМ | рек. GP | рек. NP | рек. VP40 | рек. VP35 | рек. VP24 | рек. GP | рек. NP | рек. VP40 | рек. VP35 | рек. VP24 | ||
| 1 | ЧС (1/500) | + | - | + | + | + | + | 800 | 12800 | 8100 | 8100 | 6400 |
| 2 | IgG лошади (1/1500) | + | - | + | + | + | + | 1600 | 72900 | 40500 | 13500 | 1600 |
| 3 | МАС-ВМ № 2 (1/1000) | + | + | + | + | + | + | 900 | 24300 | 8100 | 8100 | 1600 |
| 4 | МАС-рек. GP (1/1000) | + | + | - | - | - | - | 72900 | <100 | <100 | <100 | <100 |
| 5 | МАС-рек. NP (1/5000) | + | - | + | - | - | - | <100 | 218700 | <100 | <100 | <100 |
| 6 | МАС-рек. VP35 (1/5000) | + | - | - | - | + | - | <100 | <100 | 656100 | <100 | <100 |
| 7 | МАС-рек. VP40 (1/10000) | + | - | - | + | - | - | <100 | <100 | <100 | 1087500 | <100 |
| 8 | МАС-рек. VP24 (1/5000) | + | - | - | - | - | + | <100 | <100 | <100 | <100 | 202400 |
Примечания: ПАТ – поликлональные антитела иммунных сывороток; r – рек. белок;
ЧС - сыворотка человека, переболевшего ГЛМ (разведение); МАС-ВМ № 2 - пул сывороток от 3 мышей, иммунизированных АГ ВМ и используемых для гибридизации на 21-е сутки от начала иммунизации в разведении ; МАС-рек. - сыворотки мышей, иммунизированных рек. белками GP, NP, VP40, VP35, VP24 ВМ.
Таблица 5
Исследование антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса Эбола
| Источник антител | Титры специфических антител (обратные величины) и взаимодействие в ИБ | |||||||||
| Антигены (концентрация для ТИФА 1 мкг/мл ) | ||||||||||
| Инактивирован-ный ВЭ | рек.VP35 | рек.VP40 | рек.NP | рQE | ||||||
| ИФА | ИБ | ИФА | ИБ | ИФА | ИБ | ИФА | ИБ | ИФА | ИБ | |
| IgG лошади - ВЭ | 656100 | + | 121500 | + | 656100 | + | 656100 | + | <100 | - |
| МАС - ВЭ | 218700 | + | 218700 | + | 218700 | + | 656100 | + | <100 | - |
| АС крысы - ВЭ | 218700 | + | 24300 | + | 218700 | + | 218700 | + | <100 | - |
| АС кролика - ВЭ | 218700 | + | 218700 | + | 218700 | + | 656100 | + | <100 | - |
| МАС – рек. VP35 | 729000 | + | 729000 | + | <100 | - | <100 | - | <100 | - |
| МАС – рек. VP40 | 656100 | + | <100 | - | 1968300 | + | <100 | - | <100 | - |
| МАС – рек. NP – ВЭ | 656100 | + | <100 | - | <100 | - | 1968300 | + | <100 | - |
| отрицательные контроли** | <100 | - | <100 | - | <100 | - | <100 | - | <100 | - |
Примечание: МАС – мышиные антисыворотки; рQE – лизат E.coli (отрицательный контроль для рек. белков); * – проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических МАС в присутствии 1 %-го раствора лизата E.coli клеток 20 мин при 37 0С; ** – в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки лошади, мыши, крысы и кролика.
Изучение возможности использования инактивированного вируса Марбург и рекомбинантных белков для выявления специфических иммуноглобулинов класса IgG в сыворотках крови животных и человека
Описанные выше исследования рек. белков - GP, NP, VP35, VP40 и VP24 ВМ показали сходство их антигенных свойств с природными вирусными белками, что указывает на возможность использования данных препаратов в тест-системах для выявления специфических АТ.
Для анализа уровня АТ к каждому вирусному белку использовали в качестве АГ отдельные рек. белки. Это позволило определить уровень и спектр АТ к отдельным белкам ВМ (табл. 6). Наиболее высокая концентрация специфических АТ в сыворотке крови реконвалесцента была зарегистрирована к NP (1/24300) и, по убывающей, к VP40 (1/8100) и к VP35 (1/2700). Уровень специфических АТ к GP был ниже, чем к другим белкам и вообще не определялся в сыворотке, взятой у пациента через шесть лет после болезни. Такая же тенденция, по уровню АТ к индивидуальным белкам, была обнаружена и для АТ в сыворотках крови иммунизированных животных.
В случае применения в качестве АГ комбинации четырех рек. белков ВМ - GP, NP, VP35 и VP40, повышался уровень титров выявления специфических АТ исследуемых сывороток по сравнению с использованием инактивированного АГ ВМ.
Таблица 6
Использование рекомбинантных белков в качестве антигена в ТИФА для выявления IgG, специфичных к вирусу Марбург
| Источник антител | Титры специфических IgG (обратные величины) | ||||||
| Антигены (концентрация нг/лунку) | |||||||
| вирус Марбург (200) | рек.GP (200) | рек.NP (200) | рек.VP40 (200) | рек.VP35 (200) | рек. белки (400)*** | рQE (400) | |
| ЧС (1990 г.) | 24300 | 900 | 24300 | 8100 | 2700 | 24300 | <100 |
| ЧС (1996 г.) | 200 | <100 | 400 | 400 | <100 | 800 | <100 |
| IgG лошади | 218700 | 13500 | 121500 | 40500 | 13500 | 364500 | <100 |
| МАС–ВМ № 1 | 8100 | <100 | 2700 | 2700 | <100 | 8100 | <100 |
| МАС-ВМ № 2 | 24300 | 900 | 24300 | 24300 | 8100 | 72900 | <100 |
| МАС–рек.GP* | 8100 | 656100 | <100 | <100 | <100 | 72900 | <100 |
| МАС–рек.NP* | 72900 | <100 | 72900 | <100 | <100 | 24300 | <100 |
| МАС–рек.VP35* | 24300 | <100 | <100 | <100 | 656100 | 218700 | <100 |
| МАС–рек.VP40* | 72900 | <100 | <100 | 1968300 | <100 | 218700 | <100 |
| отрицательные контроли** | <100 | <100 | <100 | <100 | <100 | <100 | <100 |
Примечание: ЧС – сыворотка человека, переболевшего ГЛМ (в скобках указана дата забора крови); МАС – мышиные антисыворотки; рQE – лизат E.coli (отрицательный контроль для рек. белков);
* – проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических МАС в присутствии 1 %-го раствора лизата E.coli клеток 20 мин при 37 0С; ** – в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки человека (5 сывороток), лошади (1 сыворотка), мыши (5 сывороток); *** – смесь рек. белков GP, NP, VP35, VP40 по 100 нг/лунку каждого.
Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков вируса Марбург с помощью панели МКА
По исследованию рек. белков ВМ имеется два сообщения - об использовании рек. NP, экспрессированного в виде полноразмерных копий в бакуловирусной системе и в виде С-концевых фрагментов в E.coli, для выявления противовирусных АТ в сыворотках крови реконвалесцентов людей (M. Saijo et al., 2001) и о получении МКА, специфичных к этому рек. белку и выявляющих вирусный АГ в реакции иммунофлюоресценции (M. Saijo et al., 2005).
Для изучения рек. белков NP, VP35, VP40 ВМ, получили панель гибридомных МКА, специфичных к гомологичным вирусным белкам. Панель содержит - 3 вида МКА к NP, 3 вида МКА к белку VP35 и 9 видов МКА к VP40 (табл. 7). Для одного вида МКА 3А5 белок-мишень в ИБ не определялся, хотя он имел высокий титр в ТИФА, видимо эпитопы для этого вида МКА имеют конформационную структуру.
Специфическое взаимодействие МКА с рек. белками ВМ оценивали в ТИФА и ИБ. Как видно из представленных данных (см. табл. 7), большинство МКА активно взаимодействовали с рек. белками – аналогами вирусных белков в ТИФА. Специфическое взаимодействие рек. белков с МКА в ИБ для примера представлено на рис. 5-7. Так же было показано, что МКА, специфичные к ВМ, не имеют перекрестного взаимодействия с рек. белками гетерологичного ВЭ в ИБ и ТИФА, в отличие от данных по перекрестному взаимодействию противовирусных ПАТ с гетерологичными вирусными белками, как это было показано ранее (см. табл. 3).
 | Рис. 5. Иммуноблоттинг рекомбинантных белков NP вируса Марбург с МКА, специфичными к вирусному нуклеопротеину Цельная мембрана, содержащая: 1 – лизат клеток 293 (отрицательный контроль); 2 - лизат клеток 293, инфицированных vTF7-3 (отрицательный контроль); 3 – инактивированный ВМ; 4 – рек. NP, экспрессированный в эукариотических клетках 293; 5 – рек. NP, экспрессированный в прокариотических клетках ^ E.coli; 6 – лизат клеток E.coli (отрицательный контроль); обработана смесью МКА 5F1, 5H7 и 9С7 в разведении 1/1000 каждого. | |
 | Рис. 6. Иммуноблоттинг рекомбинантного белка VP40 с МКА, специфичными к матриксному вируса Марбург, обработан МКА 7Н10 (положительный контроль); 2 - препарат ВМ, обработан МКА 7D8 (положительный контроль); 3 – рек. белок VP40, обработан МКА 7Н10; 4 – рек. белок VP40, обработан МКА 7D8; 5 - препарат ВЭ, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль); 6 - препарат ВЭ, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль); 7 - лизат ^ E.coli, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль); 8 - лизат E.coli, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль); МКА использовали в разведении (1/500). |
Таблица 7
Анализ специфичности рекомбинантных белков вируса Марбург
| № п/п | Назва- ние МКА | Иммуно-ген | Вирусный белок- мишень в ИБ | Взаимо- действие с рек. белком- аналогом в ИБ | Титры антител в ТИФА с вирусными антигенами и рекомбинантными аналогами | |||
| вирус Марбург | рек.NP – ВМ | рек.VP40- ВМ | рек.VP35- ВМ | |||||
| 1 | 3F9 | ВМ | VP35 | + | 656100 | - | - | 729000 |
| 2 | 9D8 | ВМ | VP35 | + | 729000 | - | - | 656100 |
| 3 | 8G3 | ВМ | VP35 | - | 218700 | - | - | 72900 |
| 4 | 5G9 | ВМ | VP40 | + | 729000 | - | 72900 | - |
| 5 | 7H10 | ВМ | VP40 | + | 729000 | - | 729000 | - |
| 6 | 9G6 | ВМ | VP40 | + | 218700 | - | 218700 | - |
| 7 | 6B7 | ВМ | VP40 | + | 656100 | - | 656100 | - |
| 8 | 1C12 | ВМ | VP40 | + | 24300 | - | 24300 | - |
| 9 | 10E11 | ВМ | VP40 | + | 24300 | - | 24300 | - |
| 10 | 7D8 | ВМ | VP40 | + | 2187000 | - | 243000 | - |
| 11 | 5G8 | ВМ | VP40 | + | 656100 | - | 656100 | - |
| 12 | 7С4 | ВМ | VP40 | + | 2187000 | - | 729000 | - |
| 13 | 5F11 | ВМ | NP | + | 2187000 | 24300 | - | - |
| 14 | 9C7 | ВМ | NP | + | 6561000 | 6561000 | - | - |
| 15 | 5H7 | ВМ | NP | + | 2187000 | 2187000 | - | - |
| 16 | 3A5 | ВМ | NP (?) | - | 218700 | - | - | - |
Примечания: для иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов был использован инактивированный ВМ; NP (?) – белок – мишень не определяется этим видом МКА в ИБ и не взаимодействует с рек. белком, но по результатам КИФА имеет сродство к NP ВМ (Е.И. Казачинская, 2002); + есть реакция в данном методе; - нет реакции в данном методе; 100 нг/лунка – концентрация антигенов.
 | Рис. 7. Иммуноблоттинг с вирусных и рекомбинантных белков VP35 вируса Марбург с моноклональными антителами 1 – препарат ВМ (10 мкл), стрелкой обозначен вирусный белок VP35; 2 - препарат ВЭ (отрицательный контроль на антиген); 3 – лизат E.coli. (отрицательный котроль для рек. белка); 4 – очищенный рек. белок VP35 ВМ (10 мкл) обозначен стрелкой; все полоски мебраны обработаны препаратом очищенных МКА 3F9 в разведении 1/500; 5 – значения молекулярной массы белковых маркеров. |
| |