Получение и применение моноклональных антител и рекомбинантных белков для иммунодиагностики опасных инфекций человека 03. 01. 06. биотехнология
| Вид материала | Автореферат |
- Лабораторные методы исследования в диагностике аллергий, 15.05kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 357.26kb.
- Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
- Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым, 271.22kb.
- Сэндвич-метод иммуноферментного определения hbsAg с помощью рн чувствительных сорбируемых, 291.42kb.
- Отдаленные результаты применения моноклональных анти-ige антител в комплексной терапии, 508.34kb.
- Вопросы к зачету по дисциплине «Биотехнология», 68.5kb.
- Транспортные аварии, 102.46kb.
- Высокомолекулярные азотосодержащие органические вещества, молекулы которых построены, 51.51kb.
- Тема обмен белков. Вопросы лекции, 90.92kb.
Рек. белки VP35, NP и VP40 ВЭбыли исследованы с помощью панели гибридомных МКА, специфичных к гомологичным вирусным белкам. Специфическое взаимодействие МКА с рек. белками VP35, NP и VP40 ВЭ оценивали в ТИФА и ИБ (табл. 8). Специфическое взаимодействие рек. белков NP и VP40 ВЭ с МКА в ИБ для примера представлено на рис. 8, 9.
Было выявлено, что МКА, специфичные к ВЭ, не имели перекрестного взаимодействия с рек. белками ВМ в ИБ и ТИФА, в отличие от перекрестного взаимодействия ПАТ с вирусными белками, как это было показано ранее (см. табл. 3).
Так как вирусные белки, с которыми взаимодействовали АТ, выявляли методом ИБ, это позволо предположить, что данные эпитопы являются конформационно стабильными и, видимо, представлены “линейной” структурой как на вирусных белках, так и на их рек. аналогах. Для того чтобы выяснить, существуют ли подобные антигенные структуры на белках вириона исследовали взаимодействие МКА с инфекционным вирусным препаратом в ТИФА в условиях 4 уровня биозащиты (табл. 9). Результаты проведенного анализа демонстрируют наличие исследуемых эпитопов на белках VP35 и NP очищенных вирионов ВЭ и сохранность этих эпитопов после инактивации. Высокая специфичность взаимодействия АТ иммунной сыворотки против рек.VP35 ВЭ с очищенными инфекционными вирионами, подчеркивает подобие эпитопов рек. белка и природного VP35 ВЭ.
До начала исследований всей панели МКА методом двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” для выявления не конкурирующих за антигенные эпитопы МКА, пригодных для конструирования тест-ситемы по выявлению филовирусных АГ, пара МКА (4А8 и 6F7 из первой коллекции), были использованы при разработке метода экспресс-выявления антигена ВЭ (А.А. Чепурнов и др., 2007). Основой тест-системы служит нитроцеллюлозная мембрана с нанесенными на нее МКА 4А8 (в концентрации 0,1 мг/мл) для захвата антигена. МКА 6F7, сорбционно связанные с коллоидным золотом, служили детектирующими. Было показано выявление АГ ВЭ на вторые сутки после инфицирования в сыворотке крови сотрудника, фатально заболевшего при лабораторной аварии. Чувствительность выявления вирусного АГ составила 3 нг/мл, при титре вирусемии в сыворотке крови 105 БОЕ/мл. Эти данные служат достаточным основанием использования МКА, которые строго специфичны к внутренним вирусным белкам NP, VP40 и VP35 ВЭ и не имеют перекрестной активности c гетерологичным АГ, для разработки ИФА тест-систем для выявления АГ ВЭ.
Таблица 8
Анализ специфичности рекомбинантных белков вируса Эбола
| № п/п | Назва- ние МКА | Специ- фич- ность (вирус) | Белок- мишень | Взаимо- действиес рек. белком- аналогом в ИБ | Титры антител в ТИФА с вирусными антигенами и рекомбинатными аналогами | |||
| вирус Эбола | рек.VP35-ВЭ | рек.NP - ВЭ | рек.VP40-ВЭ | |||||
| 1 | 1C7 | ВЭ-IS | VP35 | + | 2187000 | 729000 | <100 | <100 |
| 2 | 6F7 | ВЭ -IS | VP35 | + | 729000 | 218700 | <100 | <100 |
| 3 | 1B2 | ВЭ-IS | NP | + | 2187000 | <100 | 2187000 | <100 |
| 4 | 7B11* | ВЭ-IS | NP | + | 512000 | <100 | 656100 | <100 |
| 5 | 1E5 | ВЭ-IS | NP | + | 218700 | <100 | 243000 | <100 |
| 6 | 4B9 | ВЭ-IS | NP | + | 656100 | <100 | 2187000 | <100 |
| 7 | 9A7 | ВЭ-IS | NP | + | 24300 | <100 | 72900 | <100 |
| 8 | 4А8 | ВЭ-IS | NP | + | 2187000 | <100 | 121500 | <100 |
| 9 | 10В4 | ВЭ-IS | NP | + | 2187000 | <100 | 729000 | <100 |
| 10 | 6G8 | ВЭ-IS | NP | + | 24300 | <100 | 243000 | <100 |
| 11 | 6A8 | ВЭ-IS | NP | + | 72900 | <100 | 40500 | <100 |
| 12 | 10A8 | ВЭ-IS | NP | + | 218700 | <100 | 218700 | <100 |
| 13 | 1C1 | ВЭ-8МС | VP40 | + | 6561000 | <100 | <100 | 6561000 |
| 14 | 4A2 | ВЭ-IS | VP40 | + | 6561000 | <100 | <100 | 6561000 |
| 15 | 1E6 | ВЭ-8МС | VP40 | + | 72900 | <100 | <100 | 656100 |
| 16 | 3D9 | ВЭ-8МС | VP40 | + | 729000 | <100 | <100 | 218700 |
| 17 | 1B5 | ВЭ-8МС | VP40 | + | 72900 | <100 | <100 | 656100 |
| 18 | 5С10 | ВЭ-IS | VP40 | + | 24300 | <100 | <100 | 13500 |
| 19 | 2E12 | ВЭ-IS | VP40 | + | 24300 | <100 | <100 | 24300 |
Примечания: ВЭ-IS – исходный штамм ВЭ-Заир; 8МС – штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (V.E. Volchkov et al., 2000) МКА 7B11* - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения (автор гибридомы А.В.Перебоев); + есть реакции в данном методе; 100 нг/лунка – концентрация антигенов.
 | Рис. 8. Иммуноблоттинг. Выявление вирусного белка VP35 в составе вирусного препарата ПАТ мышиной моносыворотки, специфичной к рек. белку VP35 ВЭ 1 - очищенный препарат ВЭ обработан моносывороткой к рек.VP35; 2 – рек. белок VP35 обработан нормальной АС мыши (отрицательный контроль); 3 – рек. белок VP35 обработан моносывороткой к рек.VP35 (положительный контроль); антитела использовали в разведении (1/3000). | |
| | | |
 | Рис. 9. Иммуноблоттинг. Взаимодействие МКА, специфичных к вирусному белку VP40 с рекомбинантным белком-аналогом вируса Эбола 1 - препарат ВЭ, обработан МКА 4А2; 2 - препарат ВЭ, обработан МКА 1С1; 3 – рек. белок VP40, обработан МКА 4А2; 4 – рек. белок VP40, обработан МКА 1С1; 5 - препарат ВМ, обработан МКА 4А2 (отриц. контроль); 6 - препарат ВМ, обработан МКА 1С1 (отриц. контроль); 7 - лизат ^ E.coli., обработан МКА 4А2 (отриц. контроль); 8 - лизат E.coli., обработан МКА 1С1 (отриц. контроль); МКА использовали в разведении (1/10000). | |
 | Рис. 10. Иммуноблоттинг. Взаимодействие МКА, специфичных к вирусному нуклеопротеину вируса Эбола с рекомбинантным белком: 1 - препарат ВЭ, обработан МКА 1В2; 2 - препарат ВЭ, обработан МКА 7В11; 3 – рек. NP, обработан МКА 1В2; 4 – рек. NP, обработан МКА 7В11; 5 - препарат ВМ, обработан МКА 1В2 (отриц. контроль); 6 - препарат ВМ, обработан МКА 7В11 (отриц. контроль); 7 - лизат ^ E.coli, обработан МКА 1В2 в разведении 1/500 (отриц. контроль); 8 - лизат E.coli, обработан МКА7В11 в разведении (отриц. контроль); МКА использовали в разведении (1/500). |
Таблица 9
Взаимодействие МКА, специфичных к инактивированному вирусу Эбола с нативными вирионными белками
| Источник антител | Титр антител | |
| Очищенный ВЭ* (до инактивации) | Инактивированный ВЭ** | |
| МКА 1С7 – VP35 | н.о. | 2187000 |
| МКА 6F7 – VP35 | н.о. | 729000 |
| Cмесь МКА к VP35 (1С7+6F7) | 1562500 | 312500 |
| МАС – рек.VP35 | 3125000 | 729000 |
| Cмесь МКА к NP (10А8 + 4B9+10В4+1Е5+6А8) | 3125000 | 3125000 |
| МКА 10А8 | н.о. | 218700 |
| 4В9 | н.о. | 656100 |
| 10В4 | н.о. | 2187000 |
| 1Е5 | н.о. | 218700 |
| 6А8 | н.о. | 72900 |
Примечания: Данный эксперимент провел доктор А.А. Чепурнов в условиях 4 уровня биозащиты; МАС - рек.VP35 – сыворотка мыши, иммунизированной рек. белком VP35 ВЭ; ВЭ* - инфекционный вирусный препарат; ВЭ** - вирусный АГ инактивирован 1 %-ным раствором SDS; сорбция антигенов в концентрации 100 нг/лунку; н.о – не определяли.
Отбор парных МКА не конкурирующих за антигенные эпитопы вирусных и рекомбинантных белков вируса Марбург и Эбола
Метод ИФА в формате “сэндвич” с ПАТ применяли при разработке лабораторных ИФА тест-систем для выявления ВМ в работах (А.С. Владыко и др., 1991; Н.В. Кизимов, 1993). В одной работе описаны МКА, специфичные к GP, которые были использованы в качестве “индикаторных” для выявления вирусного АГ (С.В. Ручко и др., 2001), а в другой (M. Saijo et al., 2005) для “захвата” АГ использовали МКА, специфичные к определенным перекрывающимся эпитопам (634-647 а.о. и 643-695 а.о.) рек. NP ВМ.
При разработке первых лабораторных ИФА тест-систем для выявления АГ ВЭ применяли метод ИФА в формате “сэндвич” в основном с ПАТ разных видов животных (Н.В. Мерзликин и др., 1995; T.G. Кsiazek et al., 1992) или сочетано с МКА, специфичными к вирусному белку VP40 (G. Kallstrom et al., 2005) или рек. NP (M. Niikura et al., 2001). В недавней работе зарубежных исследователей показано практическое применение двух видов МКА, специфичных к матриксному белку VP40, при исследовании проб сывороток крови, мочи, слюны и пота людей, собранных при вспышке ГЛЭ в Республике Конго в 2003 г. (A. Lucht et al., 2007). Принцип метода иммунофильтрации состоит в “сэндвиче” из МКА, один вид которых нанесен на матрицу колонки с открытым сужающимся дном, что обеспечивает хорошую промывку. Второй вид МКА, меченных биотином, реагирует с конъюгатом стрептовидина и пероксидазы. Иммунохимическую реакцию АТ с АГ проявляли раствором ТМБ. Для учета ОП реакции используют портативный фотометр или учитывают результат визуально. Данный метод для выявления вирусного АГ пригоден для полевых испытаний без использования электричества и дорогого оборудования. Время проведения анализа составляет 30 минут. Чувствительность выявления нативного вирусного АГ составила 105 БОЕ/мл. Инактивация исследуемых проб с 1 % SDS, повышашало чувствительность системы до 104 БОЕ/мл.
Создание представительной панели МКА, специфичных к трем филовирусным белкам – NP, VP40 и VP35, позволило использовать метод двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” для выявления МКА, не конкурирующих за антигенные эпитопы, то есть способных эффективно “захватывать” вирусный или рек. АГ из исследуемой пробы.
МКА, имеющие высокий титр в ТИФА в виде культуральной жидкости от гибридных культур клеток, наработали in vivo. Асцитические жидкости очищали каприловой кислотой (H. Bazin et al., 1990) с последующим высаливанием 50 %-ным раствором сульфата аммония и оценивали степень чистоты полученных препаратов МКА в ЭФ. На рисунке 11, для примера, представлены несколько из использованных в исследовании очищенных МКА. Данный метод позволяет получать очищенные МКА с четко выраженными на электрофореграмме тяжелыми (на уровне 50-55 кДа) и легкими (20-25 кДа) цепями IgG. Хорошая очистка МКА важна для исключения неспецифического фона при иммунохимических взаимодействиях, для сорбции на полистироловую поверхность планшетов большего количества IgG, несущих специфические паратопы для АГ и приготовления универсальных конъюгатов с ферментами.
 | Рис. 11 Электрофореграмма МКА, очищенных каприловой кислотой 1 - белковые маркеры молекулярной массы (10 мкл), (Bio-Rad); 2,3.4 - препараты очищенных мышиных МКА 3F9, 7D8, 7H10, специфичные к ВМ (по 1 мкл); 5,6,7 – препараты очищенных мышиных МКА 1C1, 4A2, 1В2, специфичные к ВЭ (по 1 мкл); стрелками обозначены цепи IgG. |
| |
Так же был исследован 21 вид МКА, специфичных к белкам ВЭ – два к VP35; девять к VP40; десять к нуклеопротеину. Из них было сформировано 399 различных сочетаний пар МКА. Инактивированный антиген ВЭ удовлетворительно выявляли 115 пар МКА (при ОП субстратно-индикаторной смеси в тестируемых лунках >1,0), из них 29 пар МКА выявляли рек. белки: 17 пар выявляли рек.VP40 и 14 пар – рек.NP (см. табл. 10).
Интересен был факт выявления инактивированных АГ парами МКА, специфичных к разным вирусным белкам. Эти данные предполагают высокое белок - белковое взаимодействие вирусных протеинов в вирионе, несмотря на жесткую инактивацию. По литературным данным, при исследовании структуры филовирусов методом электронной микроскопии было зафиксировано, что NP и VP40 ВЭ-Заир тесно связаны в течение вирусного морфогенеза, что является важной деталью при постановке диагноза филовирусных заболеваний (T.W. Geibert et al., 1995). При исследовании вклада филовирусных белков в формирование вирусоподобных частиц (VLPs) было показано, что NP ВЭ самостоятельно, без помощи VP40, не выходит из клеток и поэтому была предположена важная связь между этими белками (J. Licata et al., 2004).
Использование рек. белков позволяет более точно определять чувствительность выявления индивидуальных АГ. Так, по литературным данным, очищенный АГ ВЭ выявляли парой МКА, специфичных к белку VP40, до концентрации 1-2 нг/мл, что соответствовало инфекционному титру 103-104 БОЕ/мл (A. Luch et al., 2003). При использовании МКА для “захвата” АГ была показана чувствительность выявления рек. VP40 ВЭ в концентрации 2 нг/100 мкл (G. Kalstrom et al., 2005) и рек. NP в концентрации 30 нг/100 мкл (M. Niikura et al., 2001).
В данном исследовании чувствительность выявления рек. АГ разными парами МКА находилась в диапазоне концентраций от 150 до 1 нг/мл). Были выбраны четыре пары МКА, которые наиболее эффективно выявляли как очищенные вирусные АГ, так и рек. белки с чувствительностью 1 нг/мл. Это пара МКА 1В2 и 7В11, специфичные к NP ВЭ (рис. 12) и пара МКА 4А2 и 1С1, специфичные к белку VP40 ВЭ (рис. 13). Для белка VP40 ВМ это пара МКА очищенных 7D8 и меченных биотином 7H10 (рис. 14).
МКА 3F9, специфичные белку к VP35, можно одновременно эффективно использовать как в качестве “захватывающих” АГ, так и в качестве меченных биотином МКА для выявления АГ VP35 ВМ (рис. 15). В двух известных коллекциях мышиных гибридом, продуцирующих МКА к ВМ, штамм Musoke (M. Hevey et al., 1997) и штамм Рорр (С.В. Ручко и др., 2001), отсутствуют гибридомы, продуцирующие МКА к белку VP35. Это делает МКА 3F9, специфичные к VP35 ВМ особенно перспективными для дальнейшего практического использования.
Выбранные пары МКА строго специфичны к внутренним структурным вирусным белкам NP, VP40 и VP35 филовирусов, не имеют перекрестной реактивности с гетерологичными вирусными и рек. АГ. Кроме того, по результатам двухцентрового ИФА все эти 7 видов МКА, специфичные к структурным внутренним филовирусным белкам NP, VP40 и VP35, конкурируют с IgG лошадей, иммунизированных инфекциоными вирусами, за антигенные эпитопы вирусных и рек. белков. В связи с этим, показана ценность препаратов МКА при использовании их в качестве диагностических реагентов для выявления маркеров филовирусов.
Исследование иммунохимических свойств рек. белков NP, VP40 и VP35, полученных в результате экспрессии полноразмерных генов NP, VP35 и VP40 в клетках E.coli методами ИФА и ИБ, показало, что они антигенно схожи с нативными вирусными АГ и могут быть успешно применены для конструирования иммунодиагностических тест-систем в качестве положительного контроля на антиген.
Таблица 10
Данные по количеству пар МКА, исследованных в двухцентровом ИФА формата “сэндвич” для выявления антигенов вирусов Марбург и Эбола
| Общее количество исследован-ных видов МКА | Коли-чество исследо-ванных сочета-ний пар | Количество пар МКА, выявляю-щих инактиви-рованный АГ | Количество пар МКА, выявляю-щих рекомбинант-ный VP40 ВМ (совпадающих по выявлению АГ ВМ) | Количество пар МКА, выявляющих рекомби-нантный VP35 ВМ (совпадаю-щих по выявлению АГ ВМ) | Количество пар МКА, выявляю-щих рекомби-нантный VP40 ВЭ (совпадаю-щих по выявлению АГ ВЭ) | Количество пар МКА, выявляю- щих рекомби-нантный NP ВЭ (совпадаю-щих по выявлению АГ ВЭ) |
| ^ Из 16 видов МКА, специфич-ных к вирусу Марбург: 3 – к белку VP35; 9 - к белку VP40; 3 – к NP; 1 – NP (?) | 224 | 74 | 33 (11) | 5 (4) | - | - |
| ^ Из 21 вид МКА, специфич-ных к вирусу Эбола: 2 – к белку VP35; 9 - к белку VP40; 10 – к NP | 399 | 115 | - | - | 51 (17) | 42 (14) |
Рис. 12. Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного нуклеопротеина парой МКА 1B2 и 7B11*
Примечания: исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 7B11* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 9С7 и 5F11*, специфичных к NP ВМ; концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Рис. 13. Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного белка VP40
парой МКА 4А2 и 1С1*
Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 1C1* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 7D8 и 7Н10*, специфичные к белку VP40 ВМ; концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл; концентрация индикаторныхМКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Рис. 14. Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP40 парой МКА 7D8 и 7H10*
Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 7H10* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 4A2 и 1C1*, специфичные к белку VP40 ВЭа; концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Рис. 15. Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP35 парой МКА 3F9 и 3F9* Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 3F9* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали захватывающие антиген МКА 1С7, специфичные к белку VP35 ВЭ; концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1мкг/мл.
^ Применение МКА и антигенов в иммунодиагностике лихорадки Западного Нила
В серодиагностике ЛЗН используют метод ИФА для выявления специфических АТ (В.В. Распопин и др., 2007; S. Feinstein et al., 1985; W.R. Hogrefe et al., 2004). Но выраженные перекрестные реакции между ВЗН и ВКЭ, ареалы которых в России перекрываются (Д.К. Львов и др., 2000; В.А. Терновой и др., 2004; В.А. Терновой и др., 2006), затрудняют его иммунохимическую диагностику (В.В. Распопин и др., 2007). Методы выявления вируса на культуре клеток москитов или Vero (I. Samina et al., 1986; K.A. Bernard et al., 2001; R.S Nasci. et al., 1999) или внутримозговым заражением новорожденных мышей (Д.К. Львов, 2000; I. Samina et al., 1986), а так же ПЦР для выявления вирусной РНК (Д.К. Львов, 2000; В.А. Терновой и др., 2004; В.А. Терновой и др., 2006; R.S. Lanciotti et al., 2000; G.L. Surtherland et al., 2007) требуют много времени и/или дороги.
Для наблюдения вирусной активности в естественных циклах передачи и предотвращения инфекции у людей Hunt A.R. и соавт. (2002) предлагают проводить выявление вирусного АГ методом ИФА в лабораториях, не имеющих оборудования для выполнения ПЦР. Для захвата антигена в этой системе использованы МКА, специфичные к южно-африканскому штамму ВЗН, полученные T.G. Besselaar и соавт. (1988), а для детекции - группоспецифические к флавивирусам МКА, конъюгированные с пероксидазой. Чувствительность выявления очищенного АГ ВЗН (штамм NY99) в этой системе составила 320 пг/мл, а в пуле лабораторно инфицированных москитов и мозговой суспензии мышей-сосунков 103-104 PFU/мл.
В России в настоящее время выпускается только одна коммерческая тест-система ИФА на основе ПАТ для выявления АГ ВЗН (ЗАО ЭКОлаб, Московская область, г. Электрогорск).
Получение и характеризация МКА, специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (LEIV—VL99-27889-human)
Для получения гибридом, продуцирующих МКА специфичные к структурным белкам ВЗН, было проведено 3 гибридизации и в результате наблюдения в световой микроскоп было выявлено 853 лунки с гибридами, размножающимися на селективной среде ГАТ. Из них 771 гибридная популяция была оценена в ТИФА и после 2-кратного тестирования было выявлено 119 позитивных популяций гибридом, растущих в лунках. Методом предельных разведений было проведено клонирование 75 гибридом. Заморожена позитивная популяция 32 гибридом. Выход позитивных клонов гибридом, после клонирования, составил 24 гибридомы. Позитивные клеточные линии, по данным ИФА, были размножены (1-3 клона) и заложены в жидкий азот на хранение.
Препаративные количества очищенных 15-ти видов МКА, полученные из асцитических жидкостей мышей с привитыми гибридомными клетками, тестировали методом ТИФА с использованием в качестве АГ очищенного ВЗН (штамм Vlg99-27889). Результаты анализа представлены в табл. 11. Все исследованные препараты содержали высокий уровень специфических МКА. Методом ИБ показана специфичность полученых МКА (рис. 16).
Проведенные ранее исследования показали, что эти МКА позволяют нейтрализовать семь штаммов ВЗН (LEIV-VLG99-27889-human; LEIV-VLG00-27924-human; LEIV-Tur73-2914-ticks; LEIV-Az70-72-ticks; LEIV- Az67-1640-nuthatch; Ast63-94-ticks; Eg101) на культуре клеток Vero (Razumov I.A., Каzachinskaia E.I. et al., 2005). Использование РНК из мышиных гибридом, продуцирующих самые активные МКА 9Е2, позволило создать нашим коллегам в США химерную конструкцию МКА мышь/IgG1 человека, способную к протективному действию у мышей, зараженных американским штаммом NY-99 (A. Pereboev et al., 2008).
Таблица 11
Свойства МКА, специфичных к вирусу Западного Нила
| № п/п | МКА | Белок-мишень в ИБ | Субтип IgG | Титр МКА в ТИФА | Концентрация очищенных МКА (мг/мл) | |
| В асцитных жидкостях | В очищенных препаратах | |||||
| 1 | 9Е2 | Е (53 кДа) | IgG1 | >27000000 | 21870000 | 14,3 |
| 2 | 5Н6 | н.о. | IgG1 | 729000 | 656100 | 6,0 |
| 3 | 4D10 | н.о. | IgG1 | 243000 | 72900 | 7,0 |
| 4 | 7E6 | Е (53 кДа) | IgG3 | 243000 | 243000 | 8,3 |
| 5 | 5F11 | 67 кДа | IgG3 | 243000 | 243000 | 8,9 |
| 6 | 11G3 | Е (53 кДа) | IgG3 | 729000 | 810000 | 5,0 |
| 7 | 7B9 | Е (53 кДа) | IgG2b | 729000 | 729000 | 6,3 |
| 8 | 3A9 | Е (53 кДа) | IgG1 | 72900 | 72900 | 4,5 |
| 9 | 5F7 | н.о. | IgG1 | 72900 | 24300 | 1,7 |
| 10 | 4F11 | Е (53 кДа) | IgG3 | 243000 | 243000 | 5,7 |
| 11 | 3F4 | Е (53 кДа) | IgG2b | 656100 | 656100 | 6,5 |
| 12 | 1B7 | Е (53 кДа) | IgG3 | 656100 | 243000 | 4,5 |
| 13 | 2G12 | Е (53 кДа) | IgG3 | 24300 | 24300 | 2,5 |
| 14 | 7G9 | Е (53 кДа) | IgG3 | >27000000 | 2430000 | 13,5 |
| 15 | 7B2 | Е (53 кДа) | IgG1 | 24300 | 24300 | 2,5 |
| 16 | АС мыши* | Е (53 кДа); 67 кДа | все | 729000 | 2430000 | н.о. |
| 17 | АС здоровой мыши | <100 | <100 | н.о. |
Примечания: в качестве АГ в ТИФА использован очищенный препарат ВЗН (штамм Vlg99-27889); * сыворотка мышей, клетки селезенки которых были взяты для гибридизации; н.о. – не определяется.
 | Рис. 16. Иммуноблоттинг. Исследования белков очищенного вируса Западного Нила (штамм Vlg99-27889) с применением: 1 - сыворотки мышей, иммунизированных инфекционным вирусом; 2, 3, 4 – сывороток мышей, иммуннизированных инактивированным вирусным препаратом, селезенки которых были взяты в гибридизацию; 5 – 10 – очищенных препарататов МКА 9Е2,7G9, 11G3, 7F9 и 7B9, соответственно; 11, 12 - очищенных препаратов МКА 5H6 и 4D10. Справа приведены обозначения молекулярной массы по маркерам (Life technology). Все антитела использовали в разведении (1/1000); cтрелками показаны белки вирусного препарата. |
Изучение антигенных свойств препаратов ВЗН с применением МКА
МКА были получены при иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов очищенным вирусным препаратом из мозговой ткани инфицированных ВЗН мышей-сосунков.
Приготовление очищенного АГ трудоемкий и затратный процесс, так на приготовление 1 мг АГ было использовано 40 животных. Чтобы исключить наработку вирусного препарата на инфицированных животных, для дальнейших исследований использовали концентрированный АГ из инфицированных клеток Vero. С монослоя инфицированных клеток Vero (до появления явного ЦПД вируса в виде лизиса инфицированных клеток) удаляли поддерживающую среду, а клеточный дебрис в небольшом объеме среды без сыворотки осаждали низкоскоростным центрифугированием при 1000 об/мин. Осадок клеток в объеме 1 мл среды без сыворотки обрабатывали ультразвуком при 50 Вт в течение 30 секунд на тающем льду. Лизат клеток освобождали от осадка клеточных мембран центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. К аликвотам полученного лизата клеток или очищенного вирусного препарата добавляли 50 % глицерина и 1 % Nonidet P40. Супернатанты для учета инфекционного титра вируса на культуре клеток Vero получали центрифугированием (при 10000 об/мин, 4 0С) трехкратно замороженной и размороженной среды вместе с клетками, после наблюдаемого не менее 80 % ЦПД вируса на монослой зараженных клеток. Работа с инфекционным ВЗН проводилась в изолирующем боксе, так как он относится к агентам II группы патогенности по биобезопасности.
Оценку эффективности взаимодействия МКА с белками очищенного и неочищенного АГ проводили методами ТИФА и ИБ. Результаты титрования очищенного вируса и лизата инфицированных клеток Vero в ТИФА с МКА 9Е2 приведены на рис. 17. В лизате инфицированных клеток белок Е выявляется методом ИБ с МКА без фоновых полос, так же как и в очищенном вирусном препарате (рис. 18). МКА, специфичные к ВЗН не выявляли этот белок в препаратах ВКЭ и ВЯЭ.
Данные ИБ и данные титрования очищенного вируса и лизата инфицированных клеток в ТИФА свидетельствуют о высокой специфичности МКА к белку Е и возможности использования неочищенного вирусного препарата в качестве положительного контроля на АГ. Высокий уровень урожая вируса при наработке на культуре клеток Vero позволяет не использовать животных.
Рис. 17. Титрование вирусных препаратов в ТИФА с МКА 9Е2
Примечания: ВЗН – вирус Западного Нила;ВКЭ – вирус клещевого энцефалита; ВЯЭ – вирус японского энцефалита.
 | Рис. 18. Иммуноблоттинг препаратов вируса Западного Нила с МКА 9Е2
препарат в градиентах 30 % глицерина – 40 % тартрата калия - натрия, приготовленный из гомогената мозга мышей,
(штамм Eg101);
Все полоски мембраны обработаны очищенными МКА 9Е2 в разведении (1/500). |
| |