Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных 16. 00. 03. Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
| Вид материала | Автореферат |
- Иммунный статус поросят при пневмонии, вызванной вирусом репродуктивно-респираторного, 398.05kb.
- Эпизоотологический мониторинг и иммунопрофилактика классической чумы свиней и болезни, 755.76kb.
- Совершенствование системы ветеринарно-профилактических мероприятий и её влияние, 471.82kb.
- Темы рефератов для поступления в аспирантуру по научной специальности 06. 02. 02 ветеринарная, 14.27kb.
- Кудряшова жанна Алексеевна Теоретические и практические аспекты новых подходов профилактики, 392.23kb.
- Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого, 1086.61kb.
- Программа вступительного экзамена в аспирантуру по специальной дисциплине 06. 02., 270.79kb.
- Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
- Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах у коров, вызванных, 301.79kb.
- Резервуары лиссавирусов на территориях, стационарно неблагополучных по бешенству 16., 223.09kb.
На правах рукописи
ЕЗДАКОВА ИРИНА ЮРЬЕВНА
Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных
16.00.03. – Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко»
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Верховский Олег Анатольевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Поляков Виктор Филиппович
доктор медицинских наук, профессор
Булычева Татьяна Ивановна
доктор биологических наук, профессор
Емельяненко Петр Алексеевич
Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»
Защита диссертации состоится _____ __________2009 г. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И.Скрябина (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И.Скрябина.
Автореферат разослан _____ ______________ 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
профессор Грязнева Т.Н.
^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Иммунная система создавалась в процессе эволюции для распознавания биологических структур, опасных для жизни организма. В основе иммунных реакций лежит межклеточная кооперация трех основных популяций клеток: Т-, В-лимфоцитов и макрофагов. Эти клетки в различных комбинациях, на разных этапах иммунного ответа включаются в иммунные реакции, причем доля их участия зависит от вида инфекции (Цинкернагель Р.,2008). Принцип их действия основан на существовании рецепторов, которые могут быть связаны с клеткой или секретироваться в виде антител. Изучение рецепторных свойств и функций этих клеток предоставляет отличную возможность для оценки молекулярных факторов онто- и иммуногенеза.
В практическом аспекте оценка состояния иммунной системы основывается на количественной характеристике иммунокомпетентных клеток и антител, и является основой контроля эффективности и безопасности вакцин, иммунокорригирующих препаратов, использующихся в ветеринарии (Дамбаева С.В. и соавт.,2000, Обухова О.О. и соавт., 2004, Крапивина Е.В. и соавт.,2005, Донник И.М. и соавт.,2005, Крапивина Е.В. и соавт.,2006, Шахов А.Г и соавт,2006, Дегтярев В.П, 2006).
Следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных изучены недостаточно. В частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации. Ответы на эти вопросы будут способствовать разработке эффективных и безопасных вакцинных препаратов – основу специфической профилактики болезней животных.
В-, Т-клетки несут на своей поверхности специфические рецепторы, с помощью которых их можно идентифицировать. Принципы классификации рецепторов - антигенных маркеров лейкоцитов человека, выявляемых моноклональными антителами, были сформулированы на 1-м Международном совещании в Париже в 1982 г. Эти маркеры обозначили как cluster of differentiation – символом CD и соответствующими номерами. К настоящему времени создана единая номенклатура системы CD, состоящая из более 300 дифференцировочных молекул клеток человека. 30% CD-антигенов относится к суперсемейству иммуноглобулинов (IgSF), при участии которых происходит распознавание антигенов. Они содержат общие структурные элементы и характеризуются определенной пространственной доменной организацией и статистически значимой гомологией аминокислотных последовательностей (Рабсон А.,2006, Ройт А.,2000, Бурместер Г.-Р,2007 и др.). IgSF, как одни из важнейших молекул иммунной системы обеспечивают иммунную защиту от микроорганизмов, поврежденных и генетически измененных клеток, способствуя многочисленным клеточно-функциональным связям с нервной, эндокринной и другими системами.
Наиболее иммунологически значимыми белками IgSF являются:
- иммуноглобулины (Ig), существующие в двух формах: растворимые белки (антитела) и мембраносвязанные (sIg), являющиеся поверхностными рецепторами В-лимфоцитов;
- иммуноглобулиноподобные молекулы (ILT), представляющие собой мембранные рецепторы иммунокомпетентных клеток.
Среди мембраносвязывающих белков IgSF большой интерес представляют рецепторы находящиеся на поверхности Т- и НК-клеток (CD2), макрофагов (Fc- рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR – антигенный рецептор В-клетки). Функциональная и количественная характеристика данных белков является чувствительным маркером оценки состояния иммунной системы, определения эффективности применения вакцин и препаратов, используемых для химиотерапии и иммунопрофилактики (Ющук Н.Д., и соавт.,1994, Макарков А.И. и соавт., 1997, Иллек Я.Ю. и соавт.,2003, Кирюхин А.В. и соавт., 2003, Добротина Н.А. и соавт.,2005, Артюхов В.Г и соавт., 2006)
В настоящее время для оценки состояния иммунной системы разработан комплекс лабораторных методов, позволяющий выявлять изменения в организме на молекулярно-клеточном уровне. Прежде всего, это иммуноцитохимический анализ мембранных и цитоплазматических структур иммуноцитов (Дергачева Т.И. и соавт.,2000, Булычева Т.И. и соавт.,2000, Щеголева Л.С. и Добродеева Л.К.,2003, Haines D.M. и West K.H ,2005, Саидов М.З. и соавт.,2006, Высочин И.В. и соавт.,2006). Эти и другие способы определения и характеристики IgSF послужили методологической основой наших исследований.
^ Цель настоящей работы – функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза животных с использованием разноплановых методов оценки Т- и В- систем иммунитета.
^ Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:
- разработать способы получения препаратов для количественной оценки иммуноглобулинов изотипов G, М, А (IgG, IgM, IgA) в биологических жидкостях организма крупного рогатого скота и мышей;
- оптимизировать методы идентификации и количественного определения субпопуляций Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов с помощью реакции розеткообразования (Е-РО), определения фагоцитарной активности и иммуноцитохимического анализа с использованием моноклональных антител (РИФ и ИПО);
с помощью усовершенствованных методов:
- изучить функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных клеток (Т- лимфоциты, В-лимфоциты, макрофаги) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза;
- дать функциональную и рецепторную характеристику IgM крупного рогатого скота, находящегося в растворимой и связанной (sIgМ) формах, в различные периоды онтогенеза;
- провести оценку количественных изменений клеток, несущих рецепторные белки IgSF у различных видов животных.
Связь исследований с научной программой. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ 01.01.05 М (МП), 01.02.01 М ГНТП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественно определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», «Разработать методы иммуноанализа на основе поли- и моноклональных антител для оценки иммунного статуса животных и иммунологической эффективности различных биологических препаратов», 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто- и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга».
^ Научная новизна.
Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена концепция комплексного подхода к оценке состояния иммунной системы в процессе онто- и иммуногенеза на основе функционально-рецепторной характеристики белков суперсемейства иммуноглобулинов.
Установлено, что рецепторный профиль иммунокомпетентных клеток определяет их функциональную активность в реакциях различного генеза.
На основании результатов проведенных исследований:
- Получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IgМ рогатого скота (Авторское свидетельство №1560549 от 3.01.90 г.);
- Разработан способ выделения иммуноглобулина А из молозива крупного рогатого скота (патент на изобретение №2277421 от 5 апреля 2005 г.).
- Разработан способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости крупного рогатого скота (патент на изобретение №2288008 от 27 ноября 2006 г.)
- Разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение №2293330 от 10 февраля 2007 г.).
Впервые определены формы локализации поверхностных иммуноглобулинов В-клеток у крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза и проведен корреляционный анализ содержания растворимого и мембраносвязанного IgM в периферической крови животных данного вида.
Впервые изучена динамика содержания sIgМ-клеток у коров в период плодоношения.
Определены количественные показатели Т- лимфоцитов и макрофагов, а также уровень экспрессии рецепторных белков IgSF на Т- лимфоцитах мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.
^ Практическая значимость.
Практическая значимость исследования определяется тем, что систематизированы экспериментальные данные о функционально-рецепторной характеристике IgSF, содержащие выводы по методическому подходу к изучению иммунной системы животных, а также даны конкретные научно-методические рекомендации, которые позволяют интенсифицировать исследования в области ветеринарной иммунологии
На основании результатов проведенных исследований разработаны:
- «Набор компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии», утвержденным Министерством Сельского хозяйства и продовольствия РФ, ТУ№9388-0039-00008064-96, 1996 г;
- Временное наставление по применению набора компонентов для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методом радиальной иммунодиффузии №13-7-2/617, утвержденное Департаментом Ветеринарии МСХиП РФ от 27.05.96 г.;
- Методические рекомендации «Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных», рассмотренные и утвержденные в установленном порядке Сибирским отделением РАСХН, Новосибирск, 2003 г.
Рассмотрены и утверждены в установленном порядке Отделением ветеринарной медицины РАСХН:
- Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 20 мая 2005 г., протокол№1);
- Методические рекомендации по определению sIg В-клеток (иммунопероксидазное окрашивание) (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г. протокол№2);
- Методические рекомендации «Определение поверхностных структур иммунокомпетентных клеток методом иммунофлуоресценции» (секция «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 26.09.2008 г. протокол№2).
Получена серебряная медаль на 8-ой Российской агропромышленной выставке ЗОЛОТАЯ ОСЕНЬ «За Способ получения секреторного иммуноглобулина А крупного рогатого скота» (2006 г.) и золотая медаль на 10-й «За способ определения антител в иммуноцитохимическом анализе» (2008 г.)
Автор удостоен медали «Лауреат ВВЦ» в 1998 и в 2008 гг. за разработку препаратов для оценки состояния иммунной системы животных.
^ Апробация работы. Основные результаты работы доложены на:
- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2000 г.; Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, 2001 г.; Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им.К.И.Скрябина, 2004; научной конференции «30 лет развития современных направлений клеточной биотехнологии», Москва, ВИЭВ, 2005 г.; секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 2005 г.,2008 г.; Международной научной конференции «Современные проблемы клеточной биотехнологии и сохранение генетических ресурсов», Москва, 2006 г.;Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко, Москва, 2006 г.; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвященной 60-летию Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института,2006 г.; 20- 21- и 22-ой Международных ежегодных конференциях Европейского сообщества по изучению китообразных (ECS), Гдыня-2006 г., Сан-Себастьян - 2007 г., Эгмонд -2008 г.; Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы», Москва, 2008 г.; Ученом Совете, Методической комиссии ВИЭВ, 1995-2008 г.; межлабораторном заседании научных сотрудников ВИЭВ, 2009 г.
^ Основные положения, выносимые на защиту:
- разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов, Т- лимфоцитов, В- лимфоцитов и макрофагов;
- оценка содержания растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза;
- функциональные и рецепторные свойства иммунокомпетентных ILT - клеток млекопитающих, птиц и рыб в норме и при различных антигенных воздействиях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 работ в периодических изданиях, материалах научных конференций и международных форумах (12 работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ, в том числе монография «Рецепторы иммунного узнавания у животных»).
^ Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н., профессор, член-корр. РАСХН Ю.Н.Федоров, к.б.н. Т.А.Чеботарева, к.в.н. А.И.Жаданов, к.б.н. И.В.Третьякова , к.в.н. М.Н.Борисова. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи научному консультанту д.б.н., профессору О.А.Верховскому, д.б.н., профессору Л.П.Дьяконову, за организацию научных исследований д.в.н., профессору В.В.Субботину, научным сотрудникам ВИЭВ.
^ Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 310 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.
Материалы диссертации иллюстрированы 29 таблицами и 55 рисунками, включающими 43 микрофотографии. Список литературы включает 379 источника, из них 206 зарубежных авторов.