Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных 16. 00. 03. Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Вид материала

Автореферат

Содержание Характеристика растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза Формы локализации рецепторов sIgM- лимфоцитов в периферической крови коров SIgM-клетки и IgM-антитела в развитии иммунной системы у телят

Подобный материал:

• Иммунный статус поросят при пневмонии, вызванной вирусом репродуктивно-респираторного, 398.05kb.
• Эпизоотологический мониторинг и иммунопрофилактика классической чумы свиней и болезни, 755.76kb.
• Совершенствование системы ветеринарно-профилактических мероприятий и её влияние, 471.82kb.
• Темы рефератов для поступления в аспирантуру по научной специальности 06. 02. 02 ветеринарная, 14.27kb.
• Кудряшова жанна Алексеевна Теоретические и практические аспекты новых подходов профилактики, 392.23kb.
• Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого, 1086.61kb.
• Программа вступительного экзамена в аспирантуру по специальной дисциплине 06. 02., 270.79kb.
• Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
• Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах у коров, вызванных, 301.79kb.
• Резервуары лиссавирусов на территориях, стационарно неблагополучных по бешенству 16., 223.09kb.

Примечание: p 0,05: ^ - по сравнению с контролем


С целью характеристики межклеточной кооперации лимфоцитов и определения корреляционной взаимосвязи между иммунологическими показателями на фоне введения иммунотропных препаратов, были установлены коэффициенты корреляции между иммунологическими показателями. Так при введении селенопирана и нуклеината натрия корреляционная взаимосвязь между числом Т-клеток крови и тимуса, тимуса и селезенки отсутствует, а между количеством Т-лимфоцитов крови и лимфатических узлов - имеет положительное значение (r=1,0). На высоком уровне значимости (р<0,01) наблюдалась корреляционная зависимость между розеткообразующей активностью клеток крови, тимуса и лимфатических узлов на фоне введения риботана (r=0,98).

Из результатов эксперимента следует, что степень сопряженности между исследуемыми иммунологическими показателями при введении иммунокорректоров различна. Однако во всех группах постоянно сохранялась прямая корреляция показателей Т-лимфоцитов крови и лимфатических узлов (r=0,89), абсолютного числа розеткообразующих лимфоцитов крови и лейкоцитов (r=0,95), содержания лимфоцитов и Т-клеток тимуса (r=0,9). Одновременно наблюдалась сильная обратная корреляционная взаимосвязь между содержанием лимфоцитов и нейтрофилов (r=-0,9), абсолютным числом лейкоцитов и моноцитов (r=-0,88), уровнем розеткообразующих тимоцитов и количеством нейтрофилов (r=-0,9), между содержанием моноцитов и уровнем Т-клеток периферической крови.

Таким образом, можно считать, что применение иммунотропных препаратов сопровождается образованием функциональных связей между степенью розеткообразующей активности ILT-рецепторных клеток крови и лимфатических узлов и количественным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов.

Наши данные согласуются с результатами, полученными Михайленко А.А. и соавт.(2002), по корреляционному анализу и установлению корреляционных констант иммунной системы. На основании проведенных исследований, мы предлагаем диагностический алгоритм при оценке эффективности иммунотропных препаратов, включающий следующие показатели:

1. Положительная корреляция между розеткообразующей активностью клеток периферической крови и лимфатических узлов (  0,7);
   
2. Положительная корреляция между относительным содержанием лимфоцитов и розеткообразующих тимоцитов;
   
3. Отрицательная корреляция между показателями количества нейтрофилов и Т-клеток тимуса ( –0,7)
   

Разработанная схема позволяет определить уровень корреляционной связи по трем соотношениям, которые показывают адекватную реакцию иммунной системы на вводимые препараты.

Параллельно с определением показателей клеточного иммунитета, методами РДП и РИД, определяли содержание иммуноглобулинов в крови и надосадочной жидкости суспензий клеток тимуса, селезенки и лимфатических узлов. Результаты исследований показали, что иммунотропные препараты риботан и селенопиран стимулировали синтез IgG₁ и IgG2a. При этом концентрация IgG₁ в надосадочной жидкости суспензии клеток селезенки на 7 сутки после их применения составила 2,0 и 2,3 мг/мл (в контроле – 1,6 мг/мл).

Таким образом, в результате проведенных исследований, установлено, что при введении иммуномодуляторов изменяется розеткообразующая активность Т-клеток; сопровождающаяся антителогенезом, что подтверждает активацию всех звеньев иммунной системы.


^ Характеристика растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза


В онтогенезе дифференцировка в зрелые Т- и В-клетки сопровождается изменением фенотипа поверхности лимфоцита, определяемого с помощью моно- и поликлональных антител методами иммуноцитохимии. Так экспрессия cIgM на поверхности клетки играет решающую роль в В-клеточном онтогенезе. Модуляция количества sIg или блокировка их антителами приводит к изменению характера иммунных реакций, поскольку именно sIg связывают антиген на поверхности В-лимфоцита для дальнейшего его процессирования в эндосомах и представления Т-клеткам.

Нами были изучены формы локализации sIg на поверхности В-клеток в периферической крови у телят и взрослых животных в рамках исследования механизмов клеточной активации и анергии в процессе онто- и иммуногенеза. Количество sIgM-лимфоцитов определяли методами ИПО и РИФ; уровень IgM, IgG, IgA – в РИД. В исследованиях использованы МкА и поликлональные антитела к Ig крупного рогатого скота, полученные на первом этапе исследований.

^ Формы локализации рецепторов sIgM- лимфоцитов в периферической крови коров


В опытах использовали периферическую кровь крупного рогатого скота черно-пестрой породы в возрасте 4-5 лет. Иммунопероксидазное окрашивание клеток позволило определить количество sIgM-клеток, изучить модуляцию рецепторного аппарата в процессе дифференцировки В-лимфоцита в плазматическую клетку. Различные формы распределения sIg на поверхности В-клетки продемонстрированы на рис.7.

Известно, что sIgM присутствует на мембране практически всех субпопуляций В-клеток, но с различной плотностью, играющей важную роль в дифференциации клеток (Сидорова Е.В.,2006). Так негативная и позитивная селекция В-лимфоцитов зависят от плотности антигенных рецепторов на клеточной поверхности. Связывание рецептора с его лигандом сопровождается не только изменением конфигурации рецептора, но и его движением в мембране клетки. На поверхности клетки в результате этого рецепторы могут собираться в форме «петч» (неравномерное распределение sIg по периметру клетки) и «кэп» (скопление sIg на одном из полюсов клетки) с последующим погружением их в цитоплазму – эндоцитоз (рис.7б).

Подобно другим поверхностным белкам, sIg свободно перемещаются в билипидном слое плазматической мембраны клетки и при образовании комплекса с антигеном концентрируются на одном из полюсов клетки («кэппинг»- эффект рис.7-а,б). Виноградова Т.В. и др.(1995) отмечали, что основной формой расположения sIg на поверхности В-лимфоцита человека является «петч»/эндоцитоз (65%).

















а б








в г




Рис. 7. Различные формы распределения поверхностных иммуноглобулинов по периферии В-лимфоцитов. а,б – «кэп», эндоцитоз, в – «петч», г – «шеддинг»


В результате проведенных исследований нами установлено, что В-клетки в периферической крови коров с окрашенной мембраной в форме «петч»/эндоцитоз составляют 68,9±3,9%, «петч» - 15,0±3,3% (рис.7-в), «ринг» (равномерное распределение sIg по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» - 5,6±1,9%.

Исследование форм локализации sIg представляет теоретический и практический интерес, поскольку под влиянием различных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов, изменяется локализация рецепторов на поверхности клетки. По перераспределению рецепторов на мембране клетки можно судить о способности связывать антигены, т.е. характеризовать функциональную активность лимфоцита (Артюхов В.Г.и др.,2006; Новиков В.В., 2007).

Образование «кэпов» на мембране лимфоцита способствует оптимальному концентрированию иммунных комплексов на одном из полюсов клетки для образования кластеров, подвергающихся эндоцитозу.

Изменение локализации рецепторов, их перераспределение в мембране, определяет роль В-лимфоцита, как антигенпредставляющей клетки в иммунном ответе. sIg взаимодействуя с антигеном, посредством эндоцитоза включают его в цитоплазматический компартмент, где он подвергается деградации.

Помимо механизма поглощения лигандосвязанных рецепторов показан феномен сбрасывания рецепторов (шеддинг) (рис.7-г). Кластеры, состоящие из агрегированных комплексов антиген/sIg на одном из полюсов клетки, отделяются от поверхности клетки в окружающую среду. Процессы эндоцитоза и «шеддинга» являются неотъемлемой частью нормального функционирования рецепторного аппарата клетки.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о присутствии в периферической крови крупного рогатого скота В-клеток с различной локализацией поверхностных иммуноглобулинов. Основной формой распределения sIg на мембране В-лимфоцита является «петч»/эндоцитоз.


^ SIgM-клетки и IgM-антитела в развитии иммунной системы у телят


Важной задачей наших исследований является разработка специфичного метода для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота и изучения механизма дифференцировки лимфоцитов из общей лимфоидной клетки-предшественницы, поскольку первыми Ig, появляющимися в цитоплазме В-клетки, являются тяжелые цепи IgM (μ-цепи).

В эксперименте использовали периферическую кровь телят (n=15). Для постановки метода ИПО к взвеси лимфоцитов (1-2х10⁶ кл/мл) добавляли 1-3% раствор лимонной кислоты, отмывали пять раз в 0,2 М фосфатно-cолевом буфере (PBS) рН 7,2 и инкубировали с 10-15% сывороткой крови лошади в RPMI-1640 в течение 60 мин. при 22⁰С. Повторно отмывали в РВS. Затем 20 мкл взвеси лимфоцитов наносили на обезжиренное предметное стекло, высушивали, фиксировали (ацетон : этанол) и добавляли раствор МкА к IgМ рогатого скота в рабочем разведении.





Рис.8. sIgM-клетки периферической крови телят, окрашенные иммунопероксидазным методом (х900)


Далее клетки отмывали 3 раза в РВS, высушивали и наносили антитела к Ig мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (НПЦ «МедБиоСпектр). После отмывки и инкубации клетки на предметных стеклах обрабатывали AEC, промывали и высушивали. Клетки, специфически окрашенные по периферии в коричневый цвет, считали В-лимфоцитами (рис.8).

При микроскопическом исследовании препаратов установлено, что клетки периферической крови телят, экспрессирующие sIgM, составляют 19,2%. Кроме того, в результате иммуноцитохимического анализа в крови обнаружены сIgM- клетки, которые не окрашиваются по периметру из-за отсутствия sIg (рис.9). Такие клетки могут быть пре-В-клетками с цитоплазматическими μ-цепями или плазматическими клетками, секретирующими IgМ.

Рис.9. cIgM-клетки (цитоплазматическая форма) периферической крови крупного рогатого скота (х900)




Таким образом, установлено, что в периферической крови телят присутствуют В-клетки на разных стадиях дифференцировки. Основные показатели, характеризующие sIgM-клетки и IgM-антитела (секретируемая форма IgM) В-системы иммунитета телят приведены в табл.7.