Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных 16. 00. 03. Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
| Вид материала | Автореферат |
- Иммунный статус поросят при пневмонии, вызванной вирусом репродуктивно-респираторного, 398.05kb.
- Эпизоотологический мониторинг и иммунопрофилактика классической чумы свиней и болезни, 755.76kb.
- Совершенствование системы ветеринарно-профилактических мероприятий и её влияние, 471.82kb.
- Темы рефератов для поступления в аспирантуру по научной специальности 06. 02. 02 ветеринарная, 14.27kb.
- Кудряшова жанна Алексеевна Теоретические и практические аспекты новых подходов профилактики, 392.23kb.
- Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого, 1086.61kb.
- Программа вступительного экзамена в аспирантуру по специальной дисциплине 06. 02., 270.79kb.
- Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
- Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах у коров, вызванных, 301.79kb.
- Резервуары лиссавирусов на территориях, стационарно неблагополучных по бешенству 16., 223.09kb.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований
Исследования выполнены в лаборатории иммунологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко в период 1985-2008 гг.
В качестве объектов исследования использованы различные виды животных - мыши линии BALB/c, гибриды F1 (BALB/c х DBA/2) и беспородные мыши, кролики, крупный рогатый скот, куры, серебряные караси, карпы.
Материалом для исследований служили первичные (тимус, костный мозг) и вторичные (селезенка, лимфатические узлы, пейеровы бляшки) лимфоидные органы и периферическая кровь, а также перитонеальные макрофаги лабораторных мышей. Исследования иммунного статуса проводили у рыб, доставленных из рыбхозов «Гжелка» и «Биссеровский» Московской области. Отбор проб крови крупного и мелкого рогатого скота для иммунологических исследований проводили в ЗАО «Кузнецовский» Наро-Фоминского района Московской области и на опытной базе ВИЭВ о.Лисий. Образцы крови норок и SPF-кур получены в ходе совместных исследований с сотрудниками МГАВМиБ им. К.И.Скрябина и лаб. по изучению болезней птиц ВИЭВ.
Для определения уровня иммуноглобулинов, исследований по количественной характеристике и функциональной активности иммунокомпетентных клеток использовано более 5000 проб сыворотки и цельной крови мышей, крупного рогатого скота, птиц и рыб.
При изучении поверхностных структур иммунокомпетентных клеток применяли производственную вакцину против рожи свиней из штамма ВР-2 (Щелковская биофабрика), ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней (опытная серия, ВИЭВ) и производственную вакцину против парвовирусного энтерита собак (АО Ветзвероцентр).
IgG и IgA из биологических жидкостей крупного рогатого скота и мышей выделяли методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Наличие и степень чистоты полученых препаратов определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием антисыворотки к белкам крови крупного рогатого скота и мышей и методом электрофореза в полиакриламидном геле в буферной системе Laemmli U.K. (1970). Изофокусирование белков проводили в системе «Phast System» (Pharmacia, Швеция) по методике, предложенной фирмой. Иммуноблоттинг осуществляли в буферной системе H.Towbin et al (1979).
Методы исследований
Разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов и клеток с Ig-подобными рецепторами
^
Гуморальные факторы
Методы количественного определения Ig
Клеточные факторы
Методы оценки ILT – и
sIg- рецепторных клеток
Иммуногенез
Динамика ILT-рецепторных клеток мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза
Онтогенез
Характеристика растворимой и связанной форм IgM крупного рогатого скота в различные периоды онтогенеза
Филогенез
^ Функциональные свойства иммунокомпетентных ILT-рецепторных клеток у различных видов животных
Рис.1. Общая схема исследований
Гипериммунизацию кроликов породы Шиншилла с массой 2,5-3,0 кг, проводили по методу, разработанному М.А.Мисниковой и А.Ю.Самострельским.
Реакцию двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони (РДП) использовали для определения чистоты, рабочего разведения антисывороток и изотипирования антител (Фримель Х.,1979).
Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных определяли методом простой радиальной иммунодиффузии – РИД (Manchini G. et al, 1965). Количественную динамику розеткообразующих клеток определяли в реакции розеткообразования (Кондрахин И.П. и соавт., 1985), теофиллиновом тесте (Караулов А.В.,2002), антигенном розеткообразовании (Лебедев К.А. и соавт.,1981).
Фагоцитарную активность исследовали с помощью клеток дрожжей, тест-культуры ^ Staphylococcus aureus (АТСС 29213), частиц зимозана и латекса по стандартным методикам. Исследование механизмов межклеточных взаимодействий и адгезивной активности иммунокомпетентных клеток проводили в реакции контактного взаимодействия макрофагов и тимоцитов (Горбачева Л.Д. и соавт., 1981).
Для определения поверхностных иммуноглобулинов использовали цитотоксический тест – ЦТТ (Хаитов Р.М., 1995), иммунопероксидазное окрашивание клеток – ИПО (Дергачева Т.И. и др., 2000), реакцию непрямой иммунофлуоресценции – РИФ (Новикова М.С.,1990).
Для идентификации поверхностных антигенов лимфоцитов мышей использовали МкА к CD2, МкА к CD19, конъюгированные с флуорохромом (DakoCytomation) и МкА к IgM рогатого скота (лаб. иммунологии ВИЭВ).
Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами с использованием программы Excel для Windows. Значение критерия достоверности оценивали по таблице вероятностей Стьюдента-Фишера в зависимости от объема анализируемого материала. Вероятность различий считалась существенной при р < 0,05.
^ Результаты исследований
Разработка и оптимизация методов количественной оценки иммуноглобулинов и клеток с ILT- рецепторами
Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IgSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые формы иммуноглобулинов, а клеточные – связанные с мембраной, ILT- рецепторы иммунокомпетентных клеток. Задачей первого этапа нашей работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки IgG, IgM, IgA и клеток с ILT–рецепторами.
^ Выделение IgG из сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота
Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота является IgG, для его получения использовали эти биологические жидкости. В результате гель-фильтрации γ-глобулинов сыворотки крови и молозива на Sephacryl S-300 и Sepharose 6B были получены препараты IgG с примесями. В связи с этим, для выделения иммуноглобулинов G использован другой способ разделения белков – ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка.
При сравнении двух методов выделения IgG, нами установлено, что использование ионообменной хроматографии является более эффективным для получения данного изотипа иммуноглобулинов крупного рогатого скота.
^ Разработка способа получения IgА из носовых секретов и молозива крупного рогатого скота
Иммуноглобулины А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови IgA встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 kDa, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм IgA и незначительная его концентрация затрудняют его выделение из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения IgA использованы носовые секреты и молозиво, концентрация IgA, в которых является максимальной.
Как видно на иммуноэлектрофореграмме (рис.2) в сыворотке крови и в молозиве доминирующим иммуноглобулином является IgG, при этом в крови концентрация IgA очень низкая (~ 1,0 мг/мл), а в молозиве – наиболее высокая из всех биологических жидкостей. В носовом секрете количество S-IgA значительно преобладает над иммуноглобулинами других изотипов и на иммуноэлектрофореграмме не видно других линий, кроме полос преципитации соответствующих IgA. В бронхоальвеолярных смывах также преобладают S-IgА, концетрация которых не превышает 0,24 мг/мл.
Р
ис.2. Иммуноэлектрофореграмма различных биологических жидкостей КРС. (В лунках – 1- сыворотка крови, 2- сыворотка молозива, 3 – носовой секрет, 4 – слезный секрет, 5 – бронхо-альвеолярные смывы, 6 – иммунохимически чистый sIgA; в траншеях – антисыворотка против γ-глобулинов КРС)Содержание IgA в слезах достаточно высокое, достигает 2,72 мг/мл, но как видно на иммуноэлектофореграмме в слезной жидкости присутствуют и другие белковые примеси. Таким образом, наиболее оптимальной биологической жидкостью для выделения S-IgA служат носовые секреты и сыворотка молозива.
Для выделения S-IgA сыворотку молозива животных обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с Sephacryl S-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-HCl буфер рН 8,0 с 1,0 М NaCl). Для выделения S-IgA из носовых секретов крупного рогатого скота носовой секрет в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин. и диализовали против 0,02 М Тris-HCl буфера рН 8,0 два часа. Затем диализат фракционировали на колонке с Sephacryl S-300-HR.
Иммунохимическую чистоту S-IgA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.
Анализ проведенных исследований показал, что лучшим источником для выделения S-IgA являются носовые секреты, поскольку концентрация данного изотипа в них достаточно велика (2,81 мг/мл) по сравнению с IgM (0,04 мг/мл) и IgG (1,56 мг/мл) (Butler, 1986).
^ Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IgM рогатого скота
В 1990 г. нами была получена коллекция гибридом, секретирующих МкА к IgМ рогатого скота, открывшая перспективу разработки различных тест-систем на их основе (табл.1).
Таблица 1. ^ Иммунохимическая характеристика моноклональных антител
| Клоны | Изотип | Изоэлектри- ческая точка | IgG | IgA | IgM | Тип эпитопа | ||
| Пента мер | Цепи | | ||||||
| μ | L | |||||||
| С2 | IgG1 | 6,85 | - | - | + | - | - | конформационный |
| С4 | IgG1 | 7,35 | - | - | + | - | - | конформационный |
| G9 | IgG1 | 7,35 | - | - | + | - | - | конформационный |
| С11 | IgG1 | 7,35 | - | - | + | + | - | линейный |
| В3 | IgM | 8,45-8,5 | - | - | + | + | - | линейный |
Как видно из таблицы 1, полученные МкА взаимодействали только с IgM, не реагируя IgG и IgА. По результатам иммуноболоттинга, МкА клонов С2, С4 и G9 взаимодействали только с нативной молекулой IgM, что свидетельствует о конформационном характере эпитопов на молекуле IgM, распознаваемыми полученными антителами. МкА клонов С11 и В3 взаимодействовали не только с нативной молекулой, но и с тяжелой полипептидной цепью IgM, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МкА. В результате проведенных исследований были отобраны МкА С2 и G9, взаимодействующие с нативной молекулой IgM и сохранившие титр в РДП 1:32 после лиофилизации.
На основе полученных МкА С2 и G9 приготовлены реагенты для количественного определения уровня IgМ рогатого скота в биологических жидкостях организма животных в РДП и мембранных IgM (sIgM) В-клеток методами РИФ и ИПО.
^ Выделение иммуноглобулинов G1 из сыворотки крови мышей (Mus. Musculus)
Для проведения иммунологических реакций, таких как иммунодиффузия, иммуноферментное окрашивание клеток или иммунофлуоресценция, необходимо было получить моноспецифические антисыворотки к Ig мышей.
Исходным материалом для выделения иммуноглобулинов мышей служила сыворотка крови беспородных мышей, которую двукратно осаждали сульфатом аммония 50% насыщения при 40С в течение 18-20 час. Осадок отделяли центрифугированием при 1000g (45 мин.) и растворяли в физиологическом растворе, после чего проводили диализ в фосфатном буфере. Осажденные γ-глобулины концентрировали в ПЭГ-40000. Образцы при концентрации белка 10-20 мг/мл наносили на колонку с Sephacryl S-300.
Для дополнительной очистки полученных элюатов использовали ионообменную хроматографию на DEAE Sepharose 6B в градиенте NaCl. Иммунохимически чистый IgG1 получали при 0,1 М NaCl. В результате были получены иммунохимически чистые препараты IgG1 с концентрацией белка 1,6 мг/мл.
С использованием иммунохимически чистых препаратов IgG и IgA крупного рогатого скота и IgG1 мышей были изготовлены моноспецифические антисыворотки, которые использовались в дальнейших исследованиях по определению уровня иммуноглобулинов и количества иммунокомпетентных клеток, несущих на своей поверхности иммуноглобулины (sIg-клеток) при различных формах иммунного ответа.
^ Применение различных вариантов реакции розеткообразования для определения функциональной активности иммуноцитов
Ведущая роль в реакциях приобретенного иммунитета принадлежит лимфоцитам, ответственным за специфическое распознавание патогенных организмов. Взаимоотношения лимфоцитов с антигенами и между собой осуществляется посредством рецепторов клеточной мембраны, которые с помощью соответствующих внутриклеточных молекул трансформируют антигенный сигнал в клеточные реакции.
Спонтанное розеткообразование (РО) основано на присутствии на мембранах лимфоцитов рецепторов к эритроцитам. У человека это адгезивная молекула CD2, для которой на эритроцитах барана существует соответствующий лиганд CD58 (LFA-3).
Параллельно с РО изучено наличие CD2- и CD19- (аналог розеткообразующих клеток с рецептором к третьему компоненту комплемента) молекул на мембране лимфоцитов мышей методом РИФ с использованием МкА к рецепторам CD2 и CD19 мыши (табл.2).
Таблица 2. ^ Сравнительная оценка уровня Т- и В-клеток методами розеткообразования и иммунофлуоресценции (M±m)
| № п/п | Источники клеток | Е-РОК | CD2-клетки | Коэф. корр.(r) | ЗС-РОК | CD19-клетки | Коэф. корр.(r) |
| | | Т-клетки | | В-клетки | | ||
| | | Е-РО | РИФ | Е-РО /РИФ | Е-РО | РИФ | Е-РО/ РИФ |
| 1 | Кровь | 21,0±1,7 | 11,3±0,8 | 0,5* | 11,6±1,2 | 13,2 ±0,9 | 0,9 |
| 2 | Лимфатичес- кие узлы | 54,5±2,2 | 33,3±1,6 | 0,97 | 34,0±1,5 | 13,5±1,0 | 0,99 |
| | Тимус | 26,5±0,8 | 20,7±1,0 | 0,67 | 9,1±0,3 | 4,5±0,6 | 0,83 |
| 4 | Костный мозг | 41,1±2,5 | 44,8±2,1 | 0,98 | 14,2±1,4 | 22,9±1,3 | 0,97 |
| 5 | Селезенка | 25,2±0,3 | 10,7±0,9 | 0,86 | 22,3±0,4 | 25,2±1,5 | 0,87 |
Примечание. Р<0,01, * - р<0,05, n=100
Как видно из таблицы 2 , содержание иммунокомпетентных клеток с Е-розеткообразующим рецептором выше в крови (21,0%), лимфатических узлах (54,5%) и селезенке (25,2%), чем уровень CD2-клеток (11,3%, 33,3%, 10,7% соответственно). Степень сопряженности между иммунологическими параметрами Т- и В-клеток, определяемых в РО и РИФ, установлена при высоких значениях коэффициента корреляции.
Оптимизированы методы антигенного розеткообразования (А-РО), теофиллиновый тест, реакция контактного взаимодействия тимоцитов и макрофагов (РКВ) на лабораторных животных, позволяющие изучать механизмы формирования иммунного ответа на антигены различной природы.
^ Разработка способа идентификации В-лимфоцитов
К важнейшим рецепторам В-клеток относятся sIg, специфичные к одному определенному эпитопу антигена. Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембранный IgM (sIgM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации и плотности распределения sIg на поверхности В-клеток крупного рогатого скота у молодых и взрослых животных является перспективным направлением исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза. Возможно, что белки IgSF, функционирующие на поверхности мононуклеарных клеток (МНК) и в циркулирующей крови, образуют своеобразную систему иммунного контроля поверхности не только иммуноцитов, но и клеток нервной и эндокринной систем.
Для изучения локализации sIg клетки и определения количества В-лимфоцитов был оптимизирован метод иммунопероксидазного окрашивания (ИПО) клеток с использованием моно- и поликлональных антител к Ig крупного рогатого скота и мышей. Было показано, что высокочувствительный метод ИПО является оптимальным для детального исследования модуляции Ig-рецепторов, функционирующих как в мембранной (sIg) так и в цитоплазматической (cIg) формах. SIg, cIg и секретируемые (Ig) белки IgSF, являются также показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов.
При постановке метода ИПО для раcщепления пероксидазы и визуализации реакции применяли 3-амино-9-этилкарбазол (АЭК). При учете результатов к sIg-МНК относили лимфоциты с окрашенной мембраной, а к cIg-МНК – клетки с окрашенной цитоплазмой.
При апробации разработанного метода на мышах и анализе полученных результатов было установлено, что относительное содержание окрашенных клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - сIgМ, 27,5% - cIgG и 20,5% - сIgА, 10,3% лимфоцитов содержали sIgM-рецепторы. Эти данные подтвердили известный тезис о том, что костный мозг не только поставляет клетки-предшественники различных популяций лимфоцитов, но и одновременно является местом синтеза антител.
В тимусе обнаружено 18,2% тимоцитов с sIgM, 1,0% МНК с sIgG, 2,1% лимфоцитов c сIgА. В селезенке зарегистрировано 7,5% МНК с sIgM, 7,1% - sIgG и 6,3% - сIgА. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых выявлены IgG-рецепторы, являются В-клетками памяти.
В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с sIgМ и 40,5% - с IgG. Показано, что IgG распределялся в клетках лимфатических узлов следующим образом 5,0% - «ринг» - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3%- «петч» - неравномерное распределение окраски, 5,2% - «кэп» - образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% - «петч +эндоцитоз» - неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм иммуноглобулиновых рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. До 70% фолликулов лимфатического узла содержат зародышевые центры, состоящие, в основном, из пролиферирующих В-лимфоцитов, а на МНК преобладают IgG-рецепторы.
В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% МНК с sIgМ; 2,6% - sIgG; 3,8% - сIgА. Следует отметить, что IgA тимоцитов, спленоцитов, лимфоцитов костного мозга и лимфоидной ткани кишечника обнаружены только в цитоплазматической форме. Таким образом, согласно полученным результатам, уровень IgA-В-лимфоцитов превышает (3,8%) количество IgG-клеток (2,6%), что согласуется с данными о том, что основными клетками, синтезирующими IgA, являются В-лимфоциты кишечника (Conley M.E., 1987, Першин Б.Б. и соавт., 2001).
Больше всего В-лимфоцитов находится в костном мозге и лимфатических узлах. При этом, у мышей в клетках костного мозга преобладают cIg, что подтверждает его важную роль в синтезе антител.
В иммунных реакциях большое значение имеет функциональное состояние фагоцитов, в частности макрофагов. В крово- и лимфотоке постоянно циркулируют антитела, проникающие через стенку сосудов проходят в различные полости организма и взаимодействующие с клетками. Нами установлено, что на перитонеальных макрофагах мыши, полученных методом адгезии на пластике и тщательно отмытых от экзогенных иммуноглобулинов, присутствуют Fc-рецепторы как к IgG - 25,0%, так и к IgM – 23,0% и к IgA – 21,0%.
Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод, который впоследствии был использован для определения поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота.
^ Динамика ILT – рецепторных клеток мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза
В ходе превращения стволовых клеток в лимфоциты, последние приобретают поверхностные антигены CD, которые отличают их от других клеток. Клетки-предшественники лимфоцитов проходят несколько стадий деления и созревания, взаимодействуя со своим микроокружением с помощью поверхностных гликопротеинов, участвующими в передаче сигнала. Активация Т-клеток возможна как по классическому (CD3-зависимому), так и альтернативному (CD2-зависимому) пути. Блокада CD-2-зависимого способа активации приводит к нарушению иммунных процессов (Талаев В.Ю., 1999). Поэтому уровень экспрессии данных ILT- рецепторов является функционально значимым в механизме формирования иммунного ответа.
^ Динамика адгезивной активности лимфоцитов в процессе иммуногенеза (in vivo и in vitro)
Иммунный ответ при вакцинации имеет ряд особенностей, определяемых спектром воздействия вакцины - стимулирующим или супрессирующим. Учитывая, что иммуногенез начинается с активации клеток, а именно со структурных изменений их мембран, представляет интерес определение модуляции адгезивных молекул иммунокомпетентных клеток в процессах первичного и вторичного иммунного ответа.
Известно, что при кратковременной инкубации лимфоцитов с антигеном, к которому сенсибилизированы данные лимфоциты, происходит увеличение или уменьшение количества розеткообразующих клеток и, соответственно, изменяется число поверхностных рецепторов лимфоцитов. В нашей работе метод стимуляции лимфоцитов in vitro (антигенное розеткообразование) был использован для оценки динамики уровня розеткообразующих рецепторов лимфоцитов и макрофагов под действием вакцины в процессе иммуногенеза и определения индекса сдвига, показывающего активность иммунокомпетентных клеток.
Опытной группе белых мышей вводили подкожно по 0,2 см3 производственной вакцины против рожи свиней (^ Erysipelothrix rhusiopathiae) из штамма ВР (VR)-2 , контрольной - 0,2 мл физиологического раствора. Одну часть мононуклеарных клеток, полученных от этих групп мышей, инкубировали с вакциной, вторую – с физиологическим раствором в течение 30 мин. при t 37оС. На 2, 7, 14 и 20 сутки после иммунизации проводили количественное определение розеткообразующих тимоцитов и спленоцитов, индекса стимуляции (ИС), характеризующих влияние вакцины на активность МНК тимуса и селезенки мышей.