Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов в процессе онто- и иммуногенеза у животных 16. 00. 03. Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
| Вид материала | Автореферат |
- Иммунный статус поросят при пневмонии, вызванной вирусом репродуктивно-респираторного, 398.05kb.
- Эпизоотологический мониторинг и иммунопрофилактика классической чумы свиней и болезни, 755.76kb.
- Совершенствование системы ветеринарно-профилактических мероприятий и её влияние, 471.82kb.
- Темы рефератов для поступления в аспирантуру по научной специальности 06. 02. 02 ветеринарная, 14.27kb.
- Кудряшова жанна Алексеевна Теоретические и практические аспекты новых подходов профилактики, 392.23kb.
- Оптимизация системы контроля эпизоотического процесса некробактериоза крупного рогатого, 1086.61kb.
- Программа вступительного экзамена в аспирантуру по специальной дисциплине 06. 02., 270.79kb.
- Получение и использование моноклональных антител в диагностике гриппа птиц 16. 00., 455.11kb.
- Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах у коров, вызванных, 301.79kb.
- Резервуары лиссавирусов на территориях, стационарно неблагополучных по бешенству 16., 223.09kb.
Примечание. p 0,05, n=100, Т/ПМ - число адгезированных тимоцитов на поверхности 100 макрофагов. 1 группа – животные, иммунизированные ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, 2 группа – животные, иммунизированные производственной вакциной против рожи свиней из штамма ВР-2
Результаты исследований показали, что адгезивная активность перитонеальных макрофагов зарегистрирована на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-е сутки после введения вирусных антигенов (табл.5).
По-видимому, этот процесс обусловлен различными путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов в макрофагах.
Неактивированные макрофаги содержат незначительное количество молекул МНС. Их экспрессия начинается только после захвата антигена и образования фагосом или протеасом. Как следует из приведенных материалов, в первый день после вакцинации адгезивная активность макрофагов не отличалась от контроля. Если макрофаги, находящиеся в непосредственной близости от места внедрения антигена, не справляются с его уничтожением, то антиген распространяется по всему организму, в том числе, в перитонеальную полость. На 2 сутки иммунного ответа на бактериальный антиген наблюдается резкое увеличение числа тимоцитов, контактирующих с макрофагами, что связано с возросшей функциональной активностью макрофагов, сопровождающейся морфологическими и биохимическими изменениями клеток (рис.3).
Рис.3. ^ Реакция контактного взаимодействия перитонеальных макрофагов с тимоцитами (х600)
В результате повышается адгезивная активность мембран макрофагов, представляющих фрагменты антигена на своей поверхности. Второй пик повышения функциональной активности ПМ (10–14 сутки) обусловлен выполнением макрофагами роли эффекторных клеток.
В первые сутки после введения вакцины ВР-2 установлено значительное повышение количества высокоаффинных Т-клеток в костном мозге (75% , контроль – 15%), число которых на 2 сутки снижается вдвое. На 7 сутки поствакцинального иммунного ответа их уровень возрастает в лимфатических узлах (50,2%, контроль – 11%) и тимусе (60,0%, контроль – 27,0%), что характеризует активизацию клеточных реакций, как в первичных, так и во вторичных лимфоидных органах. Усиление экспрессии адгезивных CD2-молекул улучшает межклеточный контакт для обеспечения эффекторных функций иммуноцитов. В тимусе высокий уровень экспрессии CD2-рецепторов сохраняется до 14 суток поствакцинального иммунного ответа (71,0%).
Таким образом, на изменения клеточной поверхности макрофагов лабораторных мышей вследствие введения вакцины против рожи свиней, Т-клетки реагируют повышением уровня экспрессии CD2-рецепторов, играющих важную роль не только в адгезии клеток при распознавании антигена, но и в передаче антигенного сигнала внутрь Т-лимфоцита. Возрастание CD2-белков вначале на Т-клетках костного мозга, затем в тимусе и лимфатических узлах обуславливает достаточно высокую аффинность связывания комплексов молекулы МНС класса II и линейного пептида бактериальной клетки.
В отличие от формирования иммунного ответа на бактериальную вакцину, иммуногенез на вирусную вакцину сопровождается увеличением экспрессии CD2-рецепторов на Т-клетках только в костном мозге на 14 сутки после иммунизации. Это подтверждает различие в механизмах формирования иммунного ответа на вирусные и бактериальные антигены.
Рис.4^ . Динамика содержания высокоаффинных Т-клеток в лимфоидных органах мышей после иммунизации вакциной против рожи свиней.
Анализ полученных результатов показал, что при увеличении числа тимоцитов на 1-е и 7-е сутки иммунного ответа, адгезивная активность макрофагов в этот период была на уровне контроля. И наоборот, повышение числа тимоцитов, прикрепленных к поверхности макрофагов на 2-е сутки при введении бактериальной вакцины и на 3-е – вирусной, сопровождалось только незначительным повышением уровня Т-лимфоцитов. Обратно пропорциональная связь между уровнями тимоцитов и макрофагов в определенные периоды иммуногенеза, по нашему мнению, обусловлена компенсаторными механизмами в функционировании иммунной системы.
В результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что начальная фаза иммунного ответа характеризуется умеренной экспрессией CD2-рецептора во всех лимфоидных органах, кроме костного мозга, тогда как завершившие стадию дифференцировки иммунные лимфоциты отличались наличием на поверхности значительного количества CD2-молекул, что, по-видимому, связано с процессом стабилизации межклеточных взаимодействий (рис.4).
В процессе иммуногенеза установлена прямая корреляционная взаимосвязь между показателями Т-клеток в тимусе и крови (r=0,62). Сопряженность между данными параметрами объясняется поступлением части активированных тимоцитов в циркуляцию и перемещением их во вторичные лимфоидные органы.
Значительное повышение уровня высокоаффинных Т-клеток в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-клеток, направленной на контакт с В-клетками, а возможно, и для генерирования дополнительного активационного сигнала. Прямая корреляция между показателями в костном мозге и лимфатических узлах (r=0,65) свидетельствует о межклеточной кооперации Т-лимфоцитов этих органов в иммуногенезе. Отсутствие корреляционных взаимосвязей между уровнем экспрессии CD2-рецепторов на клетках костного мозга и лимфоцитах крови косвенно подтверждает теорию отрицательной селекции антигеннеспецифических лимфоцитов, которые погибают в результате апоптоза и не попадают в циркуляцию.
Можно предположить, что отрицательная корреляция показателей адгезивной активности спленоцитов и макрофагов (r= -0,64), объясняется различными функциями регуляторных и эффекторных пулов иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа.
Таким образом, адгезивные свойства мембран иммуноцитов играет важную роль в формировании адекватного иммунного ответа. Известно, что именно система контроля над рецепторной активностью клеток в процессе эволюции, преобразовалась в систему иммунологического надзора, а именно в иммунную систему млекопитающих.
^ Оценка функциональной активности В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа
Развитие и созревание В-лимфоцитов зависит от экспрессии пре-BCR (рецептор В-клеток для антигена), сформированного из молекул IgSF – sIgM и CD79, а также IL-7Rα при отсутствии которых снижается количество периферических В-клеток. Для выбора наиболее адекватного метода определения sIg-клеток животных были изучены различные реакции идентификации. Наряду с методами ИПО и РИФ, для идентификации поверхностных рецепторов клеток использовали лимфоцитотоксический тест.
I
II2
Рис.5. ^ Динамика содер-
жания В-лимфоцитов селезенки в процессе поствакцинального иммуногенеза. Время после иммунизации: 1, 3, 7, 14 сут. – первичный иммунный ответ; 1, 7, 14, 20 – вторичный. I- опыт; II-контроль.
Подопытной группе мышей вводили подкожно вакцину против рожи свиней в дозе 0,2 см3 двукратно с интервалом 30 суток. Контрольным животным вводили 0,2 см3 физиологического раствора. Процентное содержание В-лимфоцитов определяли в селезенке в различные сроки первичного и вторичного иммунного ответа (рис.5).
Как видно из данных на рис. 5, при первичном иммунном ответе увеличение процентного содержания В-лимфоцитов наблюдалось в первые сутки после введения вакцины (23,0%, контроль – 12,0%) , и на 1-е и 14-е сутки после повторной инъекции, что свидетельствует также и о повышении экспрессии sIg на клетках. Помимо количественного определения В- лимфоцитов, методом РИД в надосадочной жидкости МНК селезенки мышей определяли концентрацию IgG1 - основного изотипа иммуноглобулинов (рис.6).
Рис.6. Уровень IgG1 в надосадочной жидкости МНК селезенки в процессе поствакцинального иммуногенеза. Время после иммунизации: 1, 3, 7, 14 сут. – первичный иммунный ответ; 1, 7, 14, 20 – вторичный.
В результате проведенных исследований установлено, что в первые сутки после инъекции вакцины в селезенке достоверно повышается количество В-клеток (рис.5) и уровень IgG1 (рис.6), тогда как количество Т-клеток увеличивается только на 7-е сутки иммуногенеза.
В процессе иммунного ответа первичные фолликулы селезенки превращаются во вторичные фолликулы с зародышевым центром. В первые сутки иммунного ответа увеличивается число фолликулярных В-клеток, затем эти клетки превращаются в первичные В-бласты и центробласты, которые являются Ig-негативными. На следующей стадии активации В-клеток и образования центроцитов, экспрессия иммуноглобулинов возобновляется. Этим подтверждается изменения количества В-клеток с sIg в процессе вакцинации. Реакция в зародышевом центре селезенки продолжается около 20 суток. Полученные результаты динамики sIg-клеток методом ЦТТ подтвердили цикличность активации В-клеток селезенки в иммуногенезе.
^ Корреляционный анализ показателей ILT-рецепторных клеток при введении иммунотропных препаратов
Известно, что иммунотропные препараты широко используются для профилактики вторичных иммунодефицитных состояний животных. В соответствии с задачами нашей работы, дальнейшим этапом исследований был анализ модификации мембранных структур иммуноцитов и определение корреляционной взаимосвязи показателей ILT-рецепторных клеток под воздействием препаратов, наиболее широко используемых в ветеринарии в качестве иммуномодуляторов.
В экспериментах использованы мыши линии BALB/c, F1 (BALB/c x DBA/2) и б\п белые мыши массой 16-18 г. Животным вводили однократно, подкожно следующие препараты: 1 группе – селенопиран (0,1 см3), 2 – риботан (0,2 см3), 3 – нуклеинат натрия (0,2 см3), 4 – физиологический раствор (0,2 см3). Определение иммунологических показателей проводили на 1-е и 7-е сутки после инъекции препаратов (табл.6).
Таблица 6. ^ Влияние иммунотропных препаратов на показатели клеточного иммунитета
| Показатели | Срок исследования (сутки) | ||||||
| 1 | 7 | 1 | 7 | 1 | 7 | Контроль | |
| Селенопиран | Риботан | Нуклеинат Na | |||||
| Т-клетки крови % | 19,8 1,2 | 23,7 0,7 | 34,0 0,7 | 59,0 1,2 | 71,6 2,0 | 63,0 1,6 | 10,00,7 |
| Т-клетки лимф. узлов, % | 15,3 0,9 | 25,5 0,7 | 18,0 0,9 | 40,5 2,0 | 53,5 1,6 | 50,0 1,7 | 10,50,2 |
^ Т-клетки тимуса% | 21,8 0,7 | 17,3 1,2 | 22,0 0,9 | 43,5 1,5 | 42,7 1,2 | 67,0 1,9 | 26,50,8 |
Фаг.активностьПМ % | 10,4 1,0 | 12,8 0,9 | 24,4 0,8* | 36,9 1,0* | 20,0 0,6* | 10,5 0,07 | 9,20,3 |
^ Фаг. индекс | 2,5 0,04 | 3,7 0,04 | 7,3 0,2* | 6,6 0,05* | 4,0 0,07 | 4,2 0,1 | 3,20,06 |
| Лейкоциты тыс./мкл | 3,2 0,02 | 3,9 0,3 | 4,5 0,4 | 5,2 0,07 | 5,7 0,1 | 5,6 0,03 | 4,20,05 |
Лимфоциты% | 60,6 1,6 | 44,9 1,5 | 34,1 1,2 | 71,7 1,9 | 41,0 1,6 | 58,6 1,9 | 49,00,7 |
Нейтрофилы% | 21,6 0,9 | 50,7 1,8 | 54,8 0,9 | 23,6 0,7 | 40,6 1,4 | 34,2 1,4 | 41,20,4 |
Моноциты% | 7,0 0,8 | 4,1 0,7 | 10,1 0,5 | 4,5 0,3 | 18,0 0,7 | 10,0 0,2 | 9,60,1 |