Geum.ru

Учебное пособие составлено в соответствии с программой по биохимии для студентов всех факультетов медицинских вузов. Оно предназначено для самостоятельной подготовки студентов и оптимизации их работы на практических занятиях

Вид материалаУчебное пособие

Содержание


Работа 1. Определение b- и пре-b-липопротеинов в сыворотке крови.
Занятие 5. метаболизм мембран. перекисное окисление липидов.
Х - количество МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената, a
Подобный материал:
1   ...   16   17   18   19   20   21   22   23   ...   30

Работа 1. Определение b- и пре-b-липопротеинов в сыворотке крови.


ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Метод основан на способности гепарина образовывать с b- и пре- b- липопротеинами сыворотки крови комплекс, который под действием хлористого кальция выпадает в осадок. Концентрацию b - и пре-b -липопротеинов сыворотки крови определяют по степени мутности, которая пропорциональна концентрации липопротеинов.


ХОД РАБОТЫ.

В пробирку, содержащую 0,2 мл сыворотки крови, прилить 2 мл 0,05М хлористого кальция. Определить исходную величину оптической плотности /Д1/ на ФЭКе /красный светофильтр, 630-690 нм, кювета 0,5 см/. Перенести содержимое кюветы обратно в пробирку. К содержимому пробирки добавить микропипеткой точно! 0,04 мл гепарина, несколько раз промыв пипетку содержимым пробирки. Ровно через 5 минут измерить величину оптической плотности /Д2./ на ФЭКе.

РАСЧЕТ:

Содержание b- и пре-b-липопротеинов в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

х=(Д2 - Д1) . 12

где 12-эмпирический коэффициент для выражения b-липопротеинов в г/л.

По полученным данным рассчитать содержание b- и пре-b-липопротеинов в исследуемой сыворотке крови.

В норме содержание b- и пре-b-липопротеинов в сыворотке крови человека составляет 3,0-7,2 г/л.

РЕЗУЛЬТАТЫ:


ВЫВОДЫ:


Работа 2. Количественное определение холестерола в сыворотке крови.

ОБОРУДОВАНИЕ: ФЭК.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Холестерол в присутствии уксусного ангидрида и смеси уксусной кислоты и серной кислоты дает зеленое окрашивание – метод Илька.

ХОД РАБОТЫ

К 2,1 мл реактива Илька добавить 0,1 мл сыворотки крови, очень медленно, по стенке пробирки. Пробирку встряхнуть несколько раз, закрыть пробкой и поставить в термостат на 20 минут. (температура 370С). Пробирку из- под реактива Илька сразу промыть водой.

Колориметрировать на ФЭКе при красном светофильтре (630 – 690 нм) в кювете шириной 5 мм против воды.

Пользуясь калибровочным графиком, вычислить концентрацию холестерола в ммоль/л.

Норма 3,9 – 6,3 ммоль/л.

РЕЗУЛЬТАТЫ:


ВЫВОДЫ:


ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ:

1. Ресинтез жиров в кишечнике. Образование хиломикронов.

2. Липопротеины сыворотки крови. Классификация, строение, состав.

3. Апопротеины, классификация, функции.

4. Липопротеинлипаза, значение в метаболизме хиломикронов и ЛПОНП.

5. ЛПОНП, место синтеза, особенности состава, функции.

6. ЛПНП, образование, особенности состава. Участие ЛПОНП и ЛПНП в транспорте холестерола к тканям. ВЕ-рецепторы.

7. ЛПВП, особенности строения. Значение в обмене холестерола, лецитин-холестерол-ацилтрасфераза (ЛХАТ).

8. Гиперхолестеролемия, гиперлипопротеинемия как факторы риска развития атеросклероза.


ЗАНЯТИЕ 5.

МЕТАБОЛИЗМ МЕМБРАН. ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ.


БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Биологические мембраны играют важную роль как в структурной организации, так и в функционировании клеток и клеточных органелл. Неадекватная активация перекисного окисления липидов грозит тканям нарушением биохимических процессов в клетке с полным ее разрушением. Свободнорадикальное окисление липидов играет ведущую роль в развитии ряда заболеваний, в том числе атеросклероза, ревматоидного артрита, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваний, диабета и др. Синдром пероксидации проявляется также при низком уровне антиоксидантов, стрессе любого происхождения, действии синтетических лекарств и ксенобиотиков, гиподинамии, старении организма, гипоксических состояниях, воздействии радиоактивного и ультрафиолетового излучений. При патологии снижается активность ферментов защиты, наблюдается недостаток антиоксидантов ( витаминов Е,С ).

Работа 1. Количественное определение малонового диальдегида в ткани печени.


ОБОРУДОВАНИЕ: баня, ФЭК.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Основан на определении малонового диальдегида (МДА) как показателя перекисного окисления липидов при инкубации гомогенатов тканей в присутствии кислорода. В присутствии прооксидантов МДА определяется по специфической цветной реакции в кислой среде с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

ХОД РАБОТЫ.

В трех центрифужных пробирках приготовить инкубационную смесь реактивов по следующей схеме:
1 пробирка

“опытная”
2 пробирка

“контроль”
3 пробирка

“опытная”

с добавлением про-

оксидантов

Трис-буфер 0,15 М
3,4 мл
3,4 мл
1,4 мл

Сульфат железа FeSO4
-
-
1 мл

Аскорбиновая кислота
-
-
1 мл

ТХУ 10% раствор

с ЭДТА
-
1 мл
-

Гомогенат печени
1,0 мл
1,0 мл
1,0 мл


Все пробирки поместить в термостат при 37оС на 15 минут. После инкубации остановить реакцию в 1 и 3 пробирках, добавляя в них по 1 мл ТХУ с ЭДТА, перемешать. Все пробирки центрифугировать в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно слить в чистые пробирки. Затем в другие чистые пробирки отобрать по 4 мл надосадочной жидкости, добавить по 2 мл свежеприготовленного раствора ТБК (тиобарбитуровая кислота) и поместить пробирки в кипящую баню на 15 минут. Пробирки охладить в холодной воде и определить оптическую плотность на ФЭКе с зеленым светофильтром (длина волны 540 нм) в кювете 10 мм.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Активность ПОЛ выражается количеством микромолей МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената

.

, где

Х - количество МДА, накопленного за период инкубации в 1 мл гомогената,

a- молярный коэффициент экстинкции для малонового диальдегида при реакции с ТБК, численно равный 0.156.

Dоп и D конт - оптические плотности "опытной" и "контрольной" пробирок соответственно.

Рассчитать активность ПОЛ в 1 и 3 пробирках и сделать вывод об активности ПОЛ и влиянии ионов Fe2+ и аскорбата на перекисное окисление липидов.

ВЫВОДЫ: