Методичні вказівки та контрольні завдання з біологічної хімії для студентів факультету заочного навчання
| Вид материала | Документы |
- Львівський національний медичний університет імені данила галицького кафедра біологічної, 1655.89kb.
- Програма, методичні вказівки та контрольні завдання з дисципліни «екологія» для студентів, 566.78kb.
- Робоча програма, методичні вказівки до вивчення дисципліни та контрольні завдання для, 393.01kb.
- Програма, методичні вказівки І контрольні завдання з дисципліни "основи екології" для, 325.1kb.
- Програма, методичні вказівки та контрольні завдання з дисципліни " виробництво виливків, 797.9kb.
- Типова програма, методичні вказівки та контрольні завдання для студентів навчального, 708.32kb.
- Програма, методичні вказівки та контрольні завдання з дисципліни «охорона праці в галузі», 339.25kb.
- Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького кафедра біологічної, 1954.66kb.
- Робоча програма, методичні вказівки та індивідуальні завдання до вивчення дисципліни, 165.04kb.
- Програма, методичні вказівки та контрольні завдання з дисципліни " виробництво виливків, 864.84kb.
Енергетична цінність НАДФН + Н+ дорівнює 52,6 ккал/моль.
В процесі неокиснювальної фази пентозофосфатного шляху 6 молекул рибулозо-5-фосфату перетворюються у 5 молекул глюкозо-6-фосфату за участю ферментів транскетолази і трансальдолази. При цьому слід врахувати, що проміжні метаболіти цього шляху – фруктозо-6-фосфат і гліцеральдегід-3-фосфат – можуть включатися в аеробний і анаеробний гліколіз.
Реакції, які складають неокиснювальну фазу є зворотніми, тому шлях перетворення пентоз в гексози і шлях утворення пентоз із гексоз разом складають циклічний процес – пентозофосфатний цикл. Високий рівень активності пентозофосфатного шляху проявляється в печінці, жировій тканині, у корі наднирників, еритроцитах, лактуючій грудній залозі. Низький рівень – у скелетних м’язах, щитоподібній залозі, легенях, серці.
Біологічне значення пентозофосфатного шляху перш за все в тому, що він є єдиним джерелом відновлених еквівалентів НАДФН + Н+ в організмі, які використовуються в реакціях синтезу жирних кислот, холестерину, стероїдних гормонів, жовчевих кислот, вітаміну Д і т.д.
В еритроцитах молекули НАДФН(Н+) підтримують високий рівень відновленого глутатіону, який захищає ненасичені жирні кислоти мембран від пероксидного окиснення ліпідів. Недостатність в еритроцитах глюкозо-6-фосфатдегідрогенази призводить до порушення утворення НАДФН(Н+), в результаті – до гемолізу еритроцитів.
Значення пентозного шляху також полягає в тому, що він поставляє пентози для синтезу нуклеотидів і нуклеїнових кислот.
Глюкоза є одним з основних джерел енергії клітин всіх тканин і органів, особливо нервової системи, еритроцитів, нирок, сім’яників. Мозок забезпечується енергією майже повністю за рахунок глюкози, яка поступає дифузно, так як вищі жирні кислоти в клітини мозку не проникають через гематоенцефалічний бар’єр. Тому при зниженні концентрації глюкози у крові порушується функціонування мозку.
В анаеробних умовах глюкоза є єдиним джерелом енергії для роботи скелетних м’язів. Утворений з глюкози лактат потім поступає з кров’ю в печінку, де перетворюється в глюкозу, яка пізніше повертається у м’язи (цикл Корі).
Біологічне значення глюконеогенезу заключається не тільки у поверненні лактату в метаболічний фонд, але і в підтриманні концентрації глюкози на достатньому рівні при недостатності вуглеводів в організмі, наприклад при вуглеводному або повному голодуванні і цукровому діабеті.
Це досягається безперервним синтезом D-глюкози в організмі з невуглеводних компонентів, таких, як піруват, лактат, гліцерин, деяких глікогенних амінокислот і більшості проміжних метаболітів циклу трикарбонових кислот. Жирні кислоти не використовуються в глюконеогенезі, так як в процесі окиснення вони розпадаються до ацетил-КоА, а останній не може перетворюватися в ПВК. Глюконеогенез протікає в основному в печінці і кірковій речовині нирок. В м’язах синтез глюкози не відбувається, так як відсутні ферменти обхідних реакцій глюконеогенезу.
Глюконеогенез протікає по тому ж шляху, що і гліколіз, але у зворотньому напрямку. Однак три реакції гліколізу – незворотні (1-ша, 3-тя, 10-та), і на цих стадіях реакції глюконеогенезу йдуть в обхід гліколітичного шляху.
Перша обхідна стадія синтезу глюкози – перетворення пірувату у фосфоенолпіруват через оксалоацетат – складається з трьох реакцій і каталізується піруваткарбоксилазою і фосфоенолпіруваткарбоксикіназою.
Друга обхідна стадія – дефосфорилювання фруктозо-1,6-дифосфату з утворенням фруктозо-6-фосфату – каталізується фруктозо-1,6-дифосфатазою (біфосфатазою).
Третя обхідна стадія – дефосфорилювання глюкозо-6-фосфату з утворенням вільної глюкози – каталізується глюкозо-6-фосфатазою. При цьому необхідно враховувати, що фермент глюкозо-6-фосфатаза відсутній у м’язах, клітинах мозку і жирових тканинах, тому вони не забезпечують поступлення у кров вільної глюкози. Сумарна реакція глюконеогенезу: 2ПВК + 4АТФ + 2ГТФ + 2НАДФН(Н+) + 4Н2О глюкоза + 2НАД+ + 4АДФ + 2ГДФ + 6Н3РО4.
Таким чином:
1). Обхідні стадії глюконеогенезу незворотні, відповідно, шлях перетворення пірувату у глюкозу неідентичний відповідному катаболічному шляху розпаду глюкози (гліколізу);
2). В процесі глюконеогенезу, на утворення кожної молекули глюкози, залежно від вихідного субстрату, затрачається до 6 макроергів і 2 відновлених еквівалентів НАДФН + Н+;
3). Глюконеогенез і гліколіз регулюються реципрокно;
4). Процес глюконеогенезу перешкоджає накопиченню лактату в напружено працюючих м’язах;
5). Вживання великої кількості алкоголю різко гальмує глюконеогенез у печінці, в результаті чого знижується вміст глюкози в крові, що несприятливо впливає на функції мозку;
6). За добу в здоровому організмі синтезується до 80 г глюкози;
7). Швидкість глюконеогенезу підвищується при наступних станах:
а) голодуванні;
б) посиленому білковому харчуванні;
в) недостатньому поступленні вуглеводів з їжею;
г) цукровому діабеті.
Препарати глюкози, похідні вуглеводів (серцеві глікозиди) широко використовуються в медицині. Серцеві глікозиди до недавнього часу вважалися основою медикаментозного лікування серцевої недостатності. При поступленні серцевих глікозидів у міокард вони легко зв’язуються із сульфгідрильними групами транспортної АТФази клітинної мембрани. Унаслідок цього знижується інтенсивність розщеплення АТФ, гальмується діяльність електролітних помп. Результатом таких процесів є підвищення концентрації кальцію всередині клітини, зниження ступеня тропонінової блокади, посилення взаємодїї актину і міозину, посилення скоротливості міокарду. Таким чином, серцеві глікозиди призводять до підвищення сили і швидкості скорочення міокарду на фоні менших затрат енергії. Робота міокарду стає більш економною, коли серце здатне виконати ту ж або більшу роботу з меншою затратою енергії. Невипадково при вираженій серцевій недостатності серцеві глікозиди називають “інсуліном серцевих хворих”. Серед проявів серцевих глікозидів необхідно враховувати і їх деякий небезпосередній діуретичний ефект, який проявляється за рахунок зниження реабсорбції натрію в ниркових канальцях.
ХІД ВИКОНАННЯ ПРАКТИЧНОГО ЗАНЯТТЯ
Визначення активності -амілази в біологічних рідинах широко використовується в клінічній практиці з метою діагностики захворювань підшлункової залози. В нормі активність амілази (діастази) сечі і сироватки крові знаходиться в границях 16-64 одиниць Вольгемута. Величини більше 256 одиниць вказують на гостре запалення підшлункової залози.
Д о с л і д 1. Кількісне визначення активності амілази (діастази) сечі за методом Вольгемута.
Принцип методу. Метод грунтується на визначенні мінімальної кількості ферменту, яка здатна розщепити певну кількість субстрату. Умовно за одиницю активності амілази сечі приймають кількість мл 0,1% розчину крохмалю, яку може розщепити 1 мл нерозведеної сечі при температурі 450С за 15 хв.
Матеріальне забезпечення. Сеча, 0,1% розчин крохмалю, 0,85% розчин натрію хлориду, 0,1% розчин йоду в 0,2% розчинні калію йодиду, дистильована вода, штатив з пробірками, піпетки, водяна баня (450С), термометр, газовий пальник.
Хід роботи. У дев’ять пронумерованих пробірок вносять по 1 мл 0,85% розчину натрію хлориду. В першу пробірку додають 1,0 мл сечі, перемішують та переносять 1,0 мл суміші в другу пробірку. Так само перемішують вміст другої пробірки і переносять суміш в третю пробірку і т. д. Отримують ряд розведень сумішей в геометричній прогресії, де концентрація ферменту в кожній наступній пробірці в два рази менша, ніж у попередній. З останньої пробірки 1,0 мл суміші виливають для зрівняння об’єму. Далі в кожну пробірку вносять ще по 1,0 мл 0,85% розчину натрію хлориду та по 2,0 мл 0,1% розчину крохмалю, добре перемішують і ставлять в водяну баню на 15 хв при температурі 450С.
Після інкубації пробірки виймають з водяної бані, охолоджують проточною водою, перемішують вміст кожної пробірки та ставлять по порядку в штатив. В кожну пробірку додають по 2 краплі 1% розчину калію йодиду, перемішують та відзначають останню пробірку з жовтим забарвленням, де гідроліз крохмалю пройшов повністю. Отримані дані подають у вигляді таблиці та розраховують активність амілази сечі.
| Пробірка | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| Розведен-ня сечі | 1: 2 | 1: 4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | 1:512 |
| Забарвлен-ня з йодом | Жовте | Жовте | Жовте | Жовте | Синє | Синє | Синє | Синє | Синє |
| Повний гідроліз крохмалю | + | + | + | + | - | - | - | - | - |
Наприклад: 1/16 мл сечі розщепила 2 мл 0,1% р-ну крохмалю (жовте забарвлення в пробірках №1-4 ). В 5-тій і наступних пробірках, крохмаль не розщепився (синє забарвлення).
Активність амілази:
450С 1: 2 16
А = = =32 мл 0,1% р-ну крохмалю,15 хв 1
де 16 – розведення сечі, а 2 – кількість мл доданого крохмалю, що дорівнює 32 одиницям Вольгемута. Зробити висновок.
Результатами дослідження активності діастази сечі широко користуються в клініці з метою діагностики захворювань підшлункової залози та ниркової недостатності. В нормі діастаза сечі коливається в межах 16-64 одиниць. При гострих панкреатитах активність діастази сечі та сироватки крові зростає в 10-30 разів, особливо протягом першої доби захворювання, потім поступово повертається до норми. При нирковій недостатності амілаза в сечі відсутня.
Д о с л і д 2. Визначення активності амілази в біологічних рідинах оптимізованим ензиматичним кінетичним методом за допомогою набору реагентів фірми «Ольвекс діагностикум».
Принцип методу. Під дією -амілази синтетичний субстрат ЕРС 4,6-етиліден(G7)-n-нітрофеніл-(G1)-,D-мальтогептаозид гідролізується з утворенням безбарвних нітрофенілмальтоозидів. Під дією -глюкозидази нітрофенілмальтоозиди гідролізуються до глюкози і забарвленого n-нітрофенолу. Швидкість наростання концентрації n-нітрофенолу пропорційна активності ферменту.
Кінетичний метод дослідження виконується за умови виділення монохроматизованого світлового потоку (завдяки застосуванню фотометрів з інтерференційними світлофільтрами або спектрофотометрів) з використанням термостатованої кювети (при t0 25 0C, 300C, 370C). Після початку реакції через певний проміжок часу (1 хв тричі) знаходять зміну оптичної густини. З отриманих значень розраховують середню величину зміни абсорбції Е із використанням певних (відповідних до температури інкубації) коефіцієнтів проводять розрахунок з отриманням результатів в МО/л.
Матеріальне забезпечення. Сироватка або плазма крові, сеча, набір реагентів для визначення -амілази фірми «Ольвекс діагностикум», напівавтоматичний біохімічний аналізатор “Stat fax”.
Хід роботи. Змішати робочий реагент і зразок, який досліджується у співвідношенні: сироватка (плазма) крові - 25:1; сеча – 50:1. Ретельно перемішати та інкубувати протягом 6 хвилин при 37 0С. Вимірювати екстинкцію за довжини хвилі 405 нм і визначати її зміну (Е/хв) протягом наступних трьох хвилин.