Geum.ru

Федеральное агентство по образованию бийский технологический институт (филиал)

Вид материалаУчебное пособие
6.4 Экспрессия чужеродных генов
6.4.1 Клонирование в бактериях
6.4.2 Клонирование в дрожжах
6.4.3 Клонирование в клетках животных
Подобный материал:
1   ...   9   10   11   12   13   14   15   16   ...   19

6.4 Экспрессия чужеродных генов



Эффективность функционирования бактериальных генов не одинакова. Бактериальные гены, включенные в геном, экспрессируются достаточно легко, так как в процессах транскрипции и трансляции всех прокариот много общего.

Экспрессия генов эукариот у бактерий происходит крайне редко, так как регуляторные участки эукариот не узнаются бактериальными ДНК – полимеразами, поэтому разработаны следующие методы защиты:

а) использование ингибиторов протеаз, например, выход человеческого интерферона увеличивается примерно в четыре раза при введении гена, отвечающего за синтез ингибиторов протеаз;

б) встраивание гена в подходящий вектор экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы;

в) амплификация (увеличение числа копий). Суммарная активность экспрессируемого гена увеличивается с ростом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Используя многокопийные плазмиды, можно получить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1…2 тыс. копий на клетку без нарушения жизненно важных функций бактерий (обычно в клетке от 20 до 50 копий).

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих.

6.4.1 Клонирование в бактериях

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в клетке E.coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид E.coli и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей).

Bacillus subtilis – непатогенный почвенный микроорганизм; используется для производства белков и ферментов. В этих бактериях обнаружены плазмиды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: Bacillus subtilis, E.coli, Staphylococcus aureus. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид Staphylococcus aureus, E.coli и хромосомных фрагментв Bacillus subtilis. Полученные рекомбинантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиотикам.

Стрептомицеты широко применяются в биотехнологии. С помощью клонирования получены штаммы, устойчивые к антибиотикам.


6.4.2 Клонирование в дрожжах

Среди дрожжей наиболее изучены S.serevisiae. Дрожжевая плазмида Scp1 содержит около 6300 пар оснований и имеет от 50 до 100 копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, имеют короткое время регенерации.

Процедура внедрения ДНК в клетки дрожжей достаточно проста. Целлюлозную стенку удаляют обработкой ферментами, получая сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии хлорида кальция и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов на твердой среде восстанавливает клеточную стенку. Последующая селекция заключается в выращивании клонов на среде, в которой отсутствует тот или иной компонент. При этом трансформаты легко отбираются. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании бактерий, удается достичь синтеза чужеродных белков в клетках дрожжей, например, интерферона человека.


6.4.3 Клонирование в клетках животных

В целях исследования функционирования генов высших эукариот занимаются проблемой введения генов в клетки млекопитающих. Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями.

Например, метод маркера. Метод служит для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК. Пример: предварительно получали рекомбинантную плазмиду E.coli с геном тимидинкиназы из вируса герпеса. Затем с помощью полученной плазмиды трансформировали животные клетки, дефектные по синтезу тимидинкиназы, после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде.

Также сконструировано большое количество челночных векторов, способных к репликации в животной и бактериальной клетках.

Разработана технология микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Трансформация соматических клеток млекопитающих дает возможность изучать механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, в том числе человека. Культуры клеток млекопитающих могут быть эффективным источником выделения ряда вирусных антигенов с целью получения вакцин для человека и животных.

В настоящее время разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с целью изменения свойств организмов, таких как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Такие работы были начаты на крупных яйцах амфибий, теперь продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мышей.

Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приёмной матери или дают развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген глобулина кролика, ген тимидинкиназного вируса герпеса. Выживает от 10 до 30 % яйцеклеток, доля трансгенных мышей составляет от нескольких до 40 %.

До сих пор не удается встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы, вытеснить ген и заменить его другим. Исследования проводятся с целью лечения генетических заболеваний.