Федеральное агентство по образованию бийский технологический институт (филиал)

Вид материала

6.6 Генная инженерия растений
7 ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ 7.1 История предмета
7.2 Методы и условия культивирования изолированных тканей и клеток растений
Питательные среды.
7.3 Дедифференцировка на основе каллусогенеза

Подобный материал:

1 ... 11 12 13 14 15 16 17 18 19

6.6 Генная инженерия растений

Генетическая трансформация заключается в переносе чужеродных или модифицированных генов в эукариотические клетки. В качестве векторов используются плазмиды почвенной бактерии рода Agrobacteria.

Методами генной инженерии улучшают аминокислотный состав запасных белков растений; повышают эффективность фотосинтеза; улучшают процессы усвоения азота; повышают устойчивость растений к фитопатогенам, гербицидам, насекомым, к абиотичным стрессам.

7 ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ

7.1 История предмета

Клеточная инженерия – важное направление в биотехнологии. Оно основано на использовании принципиально нового объекта – изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности – уникальном свойстве растительных клеток.

С помощью клеточной инженерии в области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизм появления раковых клеток и др.

На практике клеточная инженерия используется при селекции, получении ценных метаболитов растительного происхождения, например, дешевых лекарств, безвирусных растений, их клональное размножение и др.

Тотипотентность – способность любой соматической клетки полностью использовать свой потенциал развития, то есть способность каждой растительной клетки давать начало целому организму.

В 1922 г американец В. Роббинс и немец В. Котте независимо друг от друга показали возможность выращивания меристем кончиков корней томатов и кукурузы на синтетических питательных средах. (Меристема, от греч. меристос – делимый, образовательная ткань растений, долго сохраняющая способность к делению клеток)

С этого момента начались массовые исследования, и к 1959 г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильных условиях на специально подобранной культуральной среде.

В 1955 г. Ф. Скуг и С. Миллер открыли новый класс фитогормонов – цитокинины. При их совместном действии с другими фитогормонами – ауксинами – появилась возможность стимулировать деление клеток, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в контролирумых условиях.

В 1960 г. Коккинг (Великобритания) разработал метод получения изолированных протопластов. Это послужило толчком к получению соматических гибридов, введению в протопласты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морел и Р.Г. Бутенко предложили метод клонального микроразмножения, который сразу широко стал использоваться на практике. Под руководством Р.Г. Бутенко в 1969 г. была разработана технология культивирования одиночной клетки с помощью ткани-«няньки».

7.2 Методы и условия культивирования изолированных

тканей и клеток растений

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.

Общие требования к выращиванию следующие:

– Асептика. Фрагменты ткани или органы растения – экспланты – могут быть ингибированы токсинами микроорганизмов, поэтому все операции должны проводиться в асептических условиях.

Для этого чистую посуду стерилизуют в автоклавах, питательную среду – в автоклавах или через бактериальные фильтры. Комнаты обрабатывают хлорамином, а затем ультрафиолетовыми лампами.

Сами растительные клетки могут быть источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация. Растение промывают водой с мылом, споласкивают чистой водой, затем промывают в растворах дезинфицирующих веществ (диацида сулемы, перекиси водорода) в течение от 1 до 40 мин. После выдерживания эксплантантов в дезинфицирующем растворе, их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантантов, так как он мог быть поврежден стерилизацией.

– Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. В состав сред входят макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы в концентрации от 2 до 3 % входят в состав любой питательной среды, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного света или в темноте.

В среды обязательно вводят ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. Добавление этих фитогормонов в различных соотношениях вызывает разные типы морфогенеза.

При приготовлении твердых питательных сред для поверхностного выращивания каллусных тканей используют агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей.

Универсальной является среда Мурасиге и Скуга, она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений.

7.3 Дедифференцировка на основе каллусогенеза

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах – фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (пролиферацией) дедифференцированных клеток. Дедифференцировка – основа для создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Дедифференцировка – это возвращение клеток в меристематическое состояние, при котором они сохраняют способность к делению. У интактных растений дедифференцировка и индукция каллусогенеза возникают вследствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механических повреждениях; кроме того, необходимо присутствие ауксинов и цитокининов. Среди ауксинов чаще всего используют:

2,4-D (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту),
ИУК (индолил-3-уксусную кислоту),
НУК (α-нафтилуксусную кислоту),

Из цитокининов вносят:

кинетин,
6-БАП (6-бензиламинопурин),
зеатин.

Ауксины вызывают процессы дедифференцировки клетки, подготавливают ее к делению. Затем цитокинины инициируют деление клеток. То есть действие этих гормонов проявляется только при последовательном или одновременном внесении их в среду.

Во время процесса дедифференциации, который у всех клеток сходен, клетки должны утратить характерные черты исходной ткани. Сначала они теряют запасные вещества, затем специализированные клеточные органеллы.

Через несколько часов после перенесения экспланта в условия in virto начинается новый синтез белка. При культивировании клеток на питательной среде начинается каллусогенез, то есть в результате дедифференцировки и деления клеток будет образовываться первичный каллус. Таким образом, специализированная клетка растущей ткани становится каллусной в результате дедифференцировки, то есть восстановления у нее способности к делению.