Geum.ru

Федеральное агентство по образованию бийский технологический институт (филиал)

Вид материалаУчебное пособие
5.3 Технология культивирования микроорганизмов – продуцентов ферментов и выделение ферментов
5.4 Инженерная энзимология и ее задачи
Подобный материал:
1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   ...   19

5.3 Технология культивирования микроорганизмов –

продуцентов ферментов и выделение ферментов



Технологический процесс можно разбить на три стадии:

1) получение посевного материала;

2) получение производственной культуры методами поверхностного или глубинного культивирования;

3) выделение из готовой производственной культуры технических или очищенных ферментных препаратов.

Поверхностный метод состоит в культивировании микроорганизмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, размещенных в кюветах. Инкубацию ведут в специальном термостатируемом цехе при постоянном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха.

Глубинный метод более экономичен. Для его реализации применяются ферментеры из нержавеющей стали, снабженные устройствами для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильного воздуха.

Наиболее прогрессивен проточный метод, который обеспечивает непрерывную подачу в ферментер питательной среды и посевного материала и непрерывный отбор продуктов жизнедеятельности и микробиальной массы. Достоинством метода является возможность длительное время поддерживать в автоматическом режиме рост культуры микроорганизмов (до 200 суток).

Выделение и очистка фермента из культуры микроорганизмов – достаточно трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко используют коммерческие препараты, чистота которых составляет всего 0,1 % (то есть 99,9 % составляют примеси). К таким отраслям относят спиртовую, кожевенную, текстильную промышленность, сельское хозяйство, производство бытовой химии.

Неочищенные препараты получают в мягком режиме высушивания культуры микроорганизмов вместе с остатками питательной среды. Такие препараты получают или из экстракта культуры продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культурной жидкости продуцента, выращенного глубинным способом.

Для большинства отраслей пищевой промышленности, научных исследований и медицины требуются очищенные ферментные препараты. Источником выделения фермента может быть биомасса микроорганизмов, экстракт или фильтрат культуральной жидкости. Биомассу микроорганизмов необходимо тщательно измельчить, вплоть до разрушения субклеточных структур: лисозом, митохондрий, ядер и т.д.

Затем препараты очищают осаждением органическими растворителями, солями, после чего диализом, аффинной хроматографией, переосаждением, гель-фильтрацией, сорбцией, кристаллизацией и пр.

Так как ферменты имеют белковую природу, то особое значение придают соблюдению режимов, сохраняющих их активность при инактивации сопутствующих балластных белков. Очищенные ферменты хранят при низкой температуре (до минус 80 ºС). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты.

5.4 Инженерная энзимология и ее задачи



Развитие прикладной энзимологии долгое время сдерживалось дороговизной чистых ферментных препаратов, неустойчивостью их при хранении и невозможностью многократного использования. Принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией в 60-е года ХХ века в результате появления на стыке химии и биологии новой отрасли – инженерной энзимологии. Ее задачи заключаются в развитии прогрессивных методов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации, конструировании катализаторов с нужными свойствами и разработке научных основ их применения.

Важным этапом развития инженерной энзимологии стала разработка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.

Иммобилизованными называют ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами:

1) они представляют собой гетерогенные катализаторы, которые легко отделяются от реактивной среды;

2) могут использоваться многократно;

3) обеспечивают непрерывность каталитического процесса.

Иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечнее и в тысячи раз стабильнее свободных энзимов. Это обеспечивает высокую экономическую эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

Все носители, используемые для иммобилизации ферментов, можно разделить на две группы: органические полимерные и неорганические. К носителям предъявляются следующие требования: они должны быть нерастворимы в реакционной среде, быть разно заряженными с ферментом, иметь высокую гидрофильность, механическую прочность, химическую и биологическую стойкость, не вызывать неспецифической адсорбции и сильных конформационных изменений белка, легко активироваться.

Способы иммобилизации делятся на две группы: химические (то есть с образованием ковалентной связи) и физические.

К физическому способу относят адсорбцию, когда фермент удерживается на носителе с помощью электростатических, водородных связей, а также в силу дисперсности взаимодействий. Этот способ осуществляется на нерастворимых носителях любой природы.

Другим физическим способом является механический способ, при котором ферменты включаются в гели, сшитые поперечными связями, заключаются в капсулы, волокна, мембраны и т.д.

К химическому способу относится ковалентное связывание, которое осуществляется путем ковалентного сшивания с полимерным носителем и поперечного сшивания ковалентными связями молекул белка без носителя. Химический способ является основным в получении иммобилизованных ферментов. Такие препараты стабильны, ферменты из них не вымываются, уменьшается отрицательное влияние матрицы. Существенным недостатком является значительная инактивация ферментов.

Рисунок 4 – Методы иммобилизации ферментов


Кроме иммобилизованных ферментов используют также иммобилизованные клетки.

При использовании иммобилизованных клеток отпадает необходимость выделения и очистки ферментных препаратов, применения кофакторов, создается возможность получения полиферментных систем.

В промышленных производствах используют покоящиеся клетки, так как:

1) многие хозяйственно-ценные продукты синтезируются в стационарной фазе;

2) растущие клетки нарушают структуру носителя;

3) образующиеся дочерние клетки, покидая носитель, загрязняют целевой продукт.

Для подавления роста иммобилизованных клеток используют дефицит фитогормонов, а рост клеток бактерий тормозят добавлением антибиотиков.

В настоящее время с использованием иммобилизованных ферментов и клеток проводятся следующие промышленные процессы:

1) получение глюкозофруктозных сиропов;

2) получение оптически активных L-аминокислот из их рацемических смесей;

3) синтез L-аспарагиновой кислоты (подсластитель и подкислитель) из фумарата аммония;

4) синтез L-аланина из L-аспарагиновой кислоты;

5) синтез L-яблочной кислоты из фумаровой кислоты;

6) получение безлактозного молока;

7) получение сахаров из молочной сыворотки;

8) получение 6-аминопенициллановой кислоты (аналог пенициллина).