Під загальною редакцією проф. Малого В. П. проф. Кратенко I. С. Харків 2006

Вид материала

Содержание

Определение бактериальных эндотоксинов с использованием гемолимфы капустной белянки (Pieris brassicae)
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ БЫСТРЫХ ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Малый В.П., Полукчи А.К., Калюжный В.А.

Подобный материал:

1 ... 60 61 62 63 64 65 66 67 ... 119

Определение бактериальных эндотоксинов с использованием гемолимфы капустной белянки (Pieris brassicae)

Малый В.П.¹, Нартов П.В.¹, Гойденко А.А.², Лавелин С.Б.³

Харьковская медицинская академия последипломного образования¹, Харьковская областная клиническая инфекционная больница², Харьковский Национальный Университет им. В.Н. Каразина³

Сепсис - это тяжело протекающее инфекционное заболевание, характеризующиеся сложностью диагностики и терапии, а также сохраняющейся высокой частотой летальных исходов, что делает данную патологию одной из актуальных проблем здравоохранения. В настоящее время пусковым механизмом сепсиса считается стимуляция клеток хозяина чрезмерным количеством бактерий и их фрагментов, поступающих в кровоток. Для грамотрицательных бактерий наиболее активным и хорошо изученным фрагментом является эндотоксин, для грамположительных бактерий – пептидогликан. Эти соединения представляют собой частицы клеточных стенок соответствующих бактерий, общим компонентом как для грамотрицательных, так и для грамположительных бактерий является пептидогликан. К сожалению, в настоящее время клиническая практика не располагает доступными методами лабораторной диагностики бактериальных модулинов эндотоксинемии. Высокочувствительная реакция с лизатом амебоцитов одного из видов крабов рода Limulus характеризуется не только дороговизной, но и недостаточной специфичностью (взаимодействует только ЛПС).

В мировой практике известен метод определения бактериальных эндотоксинов с использованием гемолимфы гусениц тутового шелкопряда (Bombyx mori), предложенный японскими учеными в 2003 году. Мы решили адаптировать, разработанный японскими учеными тест к отечественным условиям, используя в качестве источника гемолимфы капустную белянку. Тест основан на каскаде реакций в гемолимфе капустной белянки (Pieris brassicae) вызванным пептидогликанами или (1,3)-β-D-глюканом, являющимися компонентами клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Основной фермент этого каскада профенол-оксидаза катализирует реакцию превращения экзогенного субстрата 3,4-дигидроксифенилаланин в меланин. Активность фермента пропорциональна концентрации бактериальных эндотоксинов. Мы апробировали этот тест у пациентов с генерализованной формой менингококковой инфекции.

Исследуемые были разделены на две группы: 1 группа (10 человек) – менингококковый менингит с тяжелым и среднетяжелым течением, подтвержденным бактериологически, молекулярно-генетически; 2 группа (10 человек) – лица с интактным ликвором (контрольная группа). Образцы ликвора забирали в объеме 0,5 мл у больных при поступлении в стационар, в рамках обычной диагностической спинномозговой пункции. Использовали одноразовые пункционные иглы и стерильные апирогенные одноразовые пробирки, для предотвращения ложноположительных результатов.

Полученные результаты исследования показали, что уровень пептидогликана в цереброспинальной жидкости пациентов с менингококковым менингитом в период разгара болезни был выше в 18 и более раз, чем в контрольной группе (р< 0,05). В последующем, в период выздоровления показатели приходили к норме. Следовательно, этот тест может также быть использован с цель определения уровня интоксикации.

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ БЫСТРЫХ ТЕСТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

Малый В.П.¹, Полукчи А.К.¹, Калюжный В.А.²

Харьковская медицинская академия последипломного образования, г. Харьков¹, областная инфнеционная клиническая больница, г. Харьков²

Быстрые тесты для этиологической расшифровки инфекционных болезней – это довольно простые в использовании диагностические наборы, которые позволяют получить результат исследования на протяжении 10-15 минут. Они являются альтернативой использованию классических диагностических тест-систем. Такие тссты приобретают особеное значение, когда нужно быстро и недорого получить результат.

Современные быстрые тесты по типу иммунологической реакции, которая лежит в основе их создания, включают несколько групп. Одна из них – иммуннохроматографические тесты, при использовании которых исследуемый образец наносят на поверхность твердой фазы – мембраны, с предварительно нанесенным на ней реагентом. При положительном результате анализа полоса, на которую был нанесен исследуемый образец, окрашена.

В основе иммунохроматографического анализа (ИХА) лежит специфическое взаимодействие антигенов и антител на хроматографической мембране после смачивания её жидкостью исследуемого образца. Такое взаимодействие происходит вследствие диффузного перемещения окрашенного коллоидным золотом (К3) индикаторного иммунного компонента ИХА, который заранее нанесен на мембрану, и антигенов или антител исследуемого образца крови после нанесения его на мембрану. Если образец содержит исследуемые антигены или антитела, последние будут взаимодействовать с жестко иммобилизо-ванными реагентами на мембране и в результате этого получается окрашенная тестовая полоска. Введенный в тест-кассету "с остатком" индикаторный окрашенный иммунный компонент диффундирует по хроматографической мембране дальше от места проявления специфической иммунной реакции и останавливается снова в контрольной полосе вследствие иммунологи-ческого взаимодействия с жестко иммобилизи-рованным там иммунным компонентом другой специфичности. Окраска контрольной полосы свидетельствует о том, что исследование было проведено корректно. Порядок проведения анализа очень простой и не требует профессиональных навыков.

Тест оценивается как положительный, отрицательный или недействительный. Как положительный тест оценивается при наличии двух четких окрашенных полос красного цвета в зонах Т и С; как отрицательный – при наличии одной четкой окрашенной полосы красного цвета в зоне С. Появление красной контрольной полосы подтверждает также и то, что был использован достаточный объем исследуемого материала и соблюдены все необходимые условия теста. Тест может оцениваться как недействительный тогда, когда контрольная полоса не проявляется. Возможно, в этом случае процедура теста была проведена с ошибкой или было внесено недостаточное количество образца.

Быстрые тесты, которые используют для лабораторной диагностики вирусных гепатитов В и С, ВИЧ-инфекции, имеют такие ограничения:

- исключительно применяются как методы качественной диагностики (есть/нет) и не могут определить концентрацию или другую количественную характеристику антигенов или антител;

- если антигены или антитела присутствуют в образцах в количествениже чувствительности метода (например, НВsАg может определяться в количестве не меньше чем 1 нг/мл), то они не определяются;

- возможная чувствительность быстрых тестов равняется 99%, относительная специфичность их близка к 99%;

- положительный результат не является окончательным и для постановки конечного диагноза должен быть подтвержден методами ИФА или ПЦР.

Любой результат должен оцениваться, учитывая клиническую картину болезни и другие лабораторные показатели.

Нами проводились исследования, целью которых было дать оценку использованию для диагностики ВИЧ-инфекции быстрых тестов. Обследовано 20 чел.: 12 с ВИЧ-инфекцией, факт которо был установлен заранее, медодом ИФА. Среди них десять были в стадии СПИД-АК, двое - носительства. В контрольную группу входило 8 чел.: 3 - с ОРВи, 1 - туберкулезом, 3 - с герпетической инфекцией и 1 - с инфекционным мононуклеозом.

Обследованным, включая контрольную группу, диагностика ВИЧ- инфекции проводилась с помощью быстрых тестов СIТО ТЕ5Т для выявления антител к вирусу, используя принцип ИХА, как описано выше. Из 12 обследованих у 12 результат был положительным.

У всех обследованных контрольной группы результаты быстрых тестов на ВИЧ-инфекцию были отрицательными (появление только одной полосы на кассете). Результаты проведенного исследования представлены в табл.

Таким образом, резюмируя данные (табл.) относительно быстрых тестов ИХА, в сравнении с ИФА, у ВИЧ-инфицированных, контрольной группы можно увидеть, что результаты, полученные разными методами, совпадают.

Сравнение результатов исследования методов ИХА и ИФА

Обследованные	Быстрые тесты (ИХА)		ИФА
	Положительные	Отрицательные	Положительные	Отрицательные
ВИЧ-инфекция	12	0	12	0
Контрольная группа	-	8	-	8

3аключение. Быстрые тесты СIТО ТЕSТ имеют высокую чувствительность и специфичность, просты в использовании, позволяют получить результат исследования на протяжении несколь-ких минут. Ихбезусловным преимуществом есть то, что они не требуют использования дорогого оборудования. Это позволяет рекомендовать быстрые иммунохроматографические тесты компании "Фармаско" как в условиях поликлиники, так и в условиях стационара. Однако, для получения более достоверных результатов, необходимо дальнейшее накопление материала. Эти исследования нами продолжаются.

Blog