Методическая разработка по подготовке и работе на лабораторном занятии №11 для студентов медицинского факультета. Тема: Генетика микроорганизмов. Основы генной инженерии. Трансдукция. Трансформация. Конъюгация

Вид материала

Методическая разработка

Содержание Виды иммунитета Кожа Слизистые оболочки (верхние дыхательные пути, ЖКТ, мочеполовая система, конъюнктива глазу) Барьерная функция лимфатических 1.Фагоциты Функции: защитная презентующая секреторная Макрофаги нейтрофилы -эозинофилы 2.NK-клетки (нормальные киллеры) противовоспалительные – ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, трансформирующий ростовой фактор. 4.Лизоцим (фагоциты) 8.Низкомолекулярные вещества и ионы - ионы галогенов, ионы водорода, жирные кислоты, фактор активации тромбоцитов 1.4.3. Источники учебной информации 3. А.И. Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Санкт-Петербург, 2002, с. - 152-163. 5. И.Л.Дикий. Микробиология. Руководство к лабораторным занятиям. Харьков 2002. с.163-167. 7. Ю.С. Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. Г.1986. с. 48 1.5. Ориентировочная основа действия (ОДД) Схема определения действия лизоцима 1.7.1. Методика проведения занятия. 1.7.2. Организационная структура лабораторного занятия Автор: доцент, к.м.н. З.М.Прокопчук Тема: Приобретенный иммунитет. Антигены. Антитела. Серологические реакции. Реакция агглютинации. Содержание занятия. Чистая культура возбудителя РА на стекле со специфическими видовыми, типовыми, агглютинирующими сыворотками Автор: доцент, кандидат биологических наук А.А.Чеснокова ... Полное содержание

Подобный материал:

• Методическая разработка по подготовке и работе на лабораторном занятии №31 для студентов, 622.65kb.
• Методическая разработка по подготовке и работе на лабораторном занятии №21 для студентов, 595.87kb.
• Методическая разработка по подготовке лабораторного занятия №41 для студентов медицинского, 1130.19kb.
• Спецкурс «Химия нуклеиновых кислот и основы генной инженерии» для студентов 4 курса, 23.71kb.
• Методическая разработка по хирургии для студентов IV курса медицинского факультета, 42.2kb.
• Методическая разработка по хирургии для студентов IV курса медицинского факультета, 67.29kb.
• План лабораторных занятий по микробиологии для студентов 3 курса лечебного факультета,, 392.08kb.
• Методическая разработка по хирургии для студентов IV курса медицинского факультета, 49.72kb.
• Рабочая программа дисциплины «Генная инженерия» Код дисциплины по учебному плану дс., 114.12kb.
• Методическая разработка для преподавателей. Тема: (для студентов курса факультета), 103.03kb.

Иммунитет – целостная система защитно-адаптационных механизмов, с помощью которых организм распознает и уничтожает все чужеродное, что попадает или возникает в нем.

Виды иммунитета:

Врожденный		Приобретенный
Видовой	Плацентарный	Естественный: Активный Пассивный	Искусственный: Активный Пассивный

Неспецифичные факторы защиты

Анатомо-физиологические	Клеточные	Гуморальные
Кожа Слизистые оболочки (верхние дыхательные пути, ЖКТ, мочеполовая система, конъюнктива глазу) Барьерная функция лимфатических узлов Выделительная функция почек Нормальная микрофлора организма человека Лихорадка Воспаление	1.Фагоциты Функции: защитная презентующая секреторная Макрофаги -мигрирующие (моноциты) -фиксированные (кл. Купфера, альвеолярные гистиоциты, кл. микроглии, остеокласты и т.п.) Микрофаги -нейтрофилы -эозинофилы 2.NK-клетки (нормальные киллеры)	1.Белки системы комплемента (С) 2.Белки системы пропердина (Р) 3.Цитокины провоспалительные (выделяют лимфоциты) – ИЛ-1,ИЛ-6, ИЛ-8, фактор некроза опухолей, интерфероны: α-интерфероны (лейкоциты), β-интерфероны (фибробласты), γ-интерфероны (лимфоциты). противовоспалительные – ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, трансформирующий ростовой фактор. 4.Лизоцим (фагоциты) 5.Лактоферин (лейкоциты) 6.Трансферин (гепатоциты) 7.Фибронектин (макрофаги, фибробласты) 8.Низкомолекулярные вещества и ионы - ионы галогенов, ионы водорода, жирные кислоты, фактор активации тромбоцитов

1.4.2. Перечень теоретических вопросов:

1. Понятие об иммунитете.

2. Виды иммунитета.

3. Неспецифичные факторы защиты.

4. Анатомо-физиологические факторы неспецифичной защиты.

5. Клеточные факторы неспецифичной защиты. Виды фагоцитирующих клеток.

6. Фагоцитоз, его роль в иммунитете. Этапы фагоцитоза.

7. Неспецифичные гуморальные факторы защиты: комплемент, лизоцим, лизины и др.


1.4.3. Источники учебной информации

Основная

1. К.Д. Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология. Г. 1980. -с.163-169.

2. В.Д.Тимаков. Микробиология. Г. 1983 - с.171-175.

3. А.И. Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Санкт-Петербург, 2002, с. - 152-163.

4. И.Л.Дикий, И.Ю.Холупяк. Микробиология. Харьков, 1999. - с.86-89.

5. И.Л.Дикий. Микробиология. Руководство к лабораторным занятиям. Харьков 2002. с.163-167.

6. М.Н. Лебедева. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. Г. 1973. с. 128.

7. Ю.С. Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии. Г.1986. с. 48

11. Лекции

Дополнительная

Словарь по микробиологии, вирусологии, иммунологии и инфекционным заболеванием. Общ.. ред. проф. Палий Г.К., К. 2004.


1.5. Ориентировочная основа действия (ОДД)

Схема определения титра комплемента по 100% гемолизу

Пробирки Компоненты	1	2	3	4	5	6	7	8	Контроль
Исследуемая Сыворотка (1:10)	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,8
Физиологический Раствор	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,2	1,5
Гемолитическая система Эритроциты барана Гемолитическая Сыворотка	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

Схема определения действия лизоцима

Пробирки Компоненты	1	2
Раствор яичного белка (1:25)	1	-
Взвесь культуры Micrococcus lysodeicticus	1	1
Физиологический раствор	-	1

Методика определения фагоцитарной активности


Метод основан на поглощении (фагоцитировании) микроорганизмов лейкоцитами при их контакте в оптимальных условиях с суточной культурой исследуемого микроба.

В пробирке смешивают гепарин, исследуемую кровь и взвесь E. coli. Инкубируют 30 мин при 37⁰С. Из смеси готовят мазки-препараты, фиксируют метанолом и красят по Романовськиому- Гимзе.

Результаты учитывают, определяя:

1. активность фагоцитоза - фагоцитарный индекс - число фагоцитирующих клеток, относительно общего числа нейтрофилов;
   
2. интенсивность фагоцитоза - фагоцитарное число - среднее число микроорганизмов, поглощенная одним нейтрофильным лейкоцитом;
   
3. завершенность фагоцитоза - индекс переваривания - отношение числа погибших микробных клеток к жизнеспособным в мазке-препарате.
   

6. Короткие методические указания для работы студентов на лабораторном занятии.
   

1.7.1. Методика проведения занятия.

1. Определить в демонстрационном опыте активность лизоцима яичного белка, поставленного по методике описанной выше.

2. Определить титр комплемента в сыворотке крови здорового человека.

3. В демонстрационных мазках-препаратах определить показатели активности фагоцитоза:

а) фагоцитарный индекс;

б) фагоцитарное число.


4. Оформить протокол, сделать выводы.


1.7.2. Организационная структура лабораторного занятия

№ этапа	Этапы работы	Время (мин.)	Средства обучение	Оборудование	Место проведение
1.	Организационная часть	3	-	-	Учебная комната
2.	Проверка первичного уровня знаний: Устно- по предыдущим вопросом Письменно - по тестам	5 10	Источники обуч. информации Тесты на исходный уровень знаний	-	-
3.	Инструктаж преподавателя по выполнению практической работы согласно методическим указаниям	5	Метод. разработка		-
4.	Самостоятельная работа студентов: Определение активности лизоцима яичного белка Определение титра комплемента в сыворотке крови Определение показателей активности фагоцитоза Оформление выводов к лабораторному занятию	10 10 25	Таблица „схема опыта действия лизоцима» Таблица „схема титрования комплемента за 100% гемолизом» Таблица ”Этапы фагоцитоза”	Штатив с демонстрационным опытом Штатив с демонстрационным опытом Демонстрационные Мазки-препараты Для определения фагоцитарной активности, микроскоп	-
5.	Оценка деятельности каждого студента и проверка усвоения темы: Устно - согласно теоретическим вопросам к занятию; Письменно - по системе обучающих задач;	10 10	Система обучающих задач
6.	Подведение итогов занятия, задача для самостоятельной работы студентов при подготовке к следующей теме	2

Автор: доцент, к.м.н. З.М.Прокопчук


Методическая разработка

по подготовке и работе на лабораторном занятии №16

для студентов медицинского факультета.


Тема: Приобретенный иммунитет. Антигены. Антитела. Серологические реакции. Реакция агглютинации.

1. 
   Актуальность темы.
   

Обусловлена широким использованием реакции агглютинаци в диагностике инфекционных заболеваний.


1.2. Цели изучения темы.


1.2.1. Цель общая.

Понять биологическую суть иммунитета как механизма, поддерживающего антигенный статус организма.


1.2.2. Цель конкретная.

Студент должен уметь ставить и оценивать результаты ориентирочной и развернутой реакции агглютинации.


1.3. Обеспечение исходного уровня знаний-умений:

1. Иммунная система, ее строение.

2. Неспецифические и специфические факторы резистентности организма.

3. Механизмы иммунитета.


1.3. Тесты на исходному уровеню знаний-умений:


1.3.1. Какие органы иммунной системы относятся к центральным:

A – вилочковая железа

B – костный мозг

C – селезенка

D – лимфатические узлы

E – печень

Правильный ответ: А, B


1.4. Содержание занятия.

Реакция агглютинации (РА) является иммунологической реакцией, которая роявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярних антигенов (бактерии, эритроциты). Характер и скорость проходжения реакции зависит от антигенного строения бактерий. Мелкозернистая О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков. При наличии жгутиков (Н-агглютинация) проявляется в оброзовании крупнохлопчатого осадка, РА достаточно специфичная и чувствительная. Она широко применяется в практике серологической диагностики инфекционных болезней для идентификации выделенного возбудителя с применением известных стандартных видовых, типовых агглютинирующих сывороток, а также для выявления в сыворотке больных агглютининов с помощью известных бактерий (диагностикумов).

В практике диагностики инфекционных болезней применяют также непрямую (писсивную) гемагглютинацию-РНГА (РПГА), включающуюся в использовании эритроцитов, поверхности которых адсорируется антиген.


1.4.1. Граф логической структуры содержания.

Использование РА в диагностике инфекционных заболеваний:

1. Идентификация возбудителя.

Исследуемый материал – выделенная чистая культура бактерий.

Постановка РА бактерий на стекле со специфическим агглютинирующими видовыми и типовыми сыворотками.

Конечный результат через 10-15 мин.

2. Определение титра антител в сыворотке больного.

Исследуемый материал – сыворотка крови больного.

Постановка развернутой РА с сывороткой больного в разведениях 1:50-1:1600 со специфическими диагностикумами.

Конечный результат через 18-20 час.


1.4.2. Перечень теоретических вопросов:

1. Определение понятия „иммунитет”.

2. Антигены, общая характеристика, детерминантные группы.

3. Антигенная структура бактериальной клетки.

4. Антитела, общая характеристика, химическихая природа.

5. Классы иммуноглобулинов, строение и функции.

6. Серологические реакции и феномены, лежащие в их основе.

7. Реакция агглютинаци (РА), ее механизм.

8. Агглютиногены, агглютинины, их свойства.

9. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), ее механизмы.

10. Методические варианты, техника постановки, диагностическое значение РА и РПГА.


1.4.3. Источники учебной информации.

Основная литература:

К.Д.Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. Мікробіологія, 1982, с.145-157, 172-177

К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, 1980, с.169-181, 195-197

В.Д.Тимаков. Микробиология, 1983, с.180-184, 188-192, 218-222

А.И.Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, Санкт-Петергбург, 2002, с.151-161, 163-171, 176-181, 229-232

О.І.Клименюк, І.О.Ситник, М.С.Творко, В.П.Широбоків. Практична мікробіологія, 2004, с.126-136

И.Л.Дикий, И.Ю.Халупяк, Н.Е.Шевелева, М.Ю.Стогний. Микробиология, Харьков, 1999, с.85-86, 89-93, 94-96, 112-114

Л.Б.Борисов. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, М., 1984, с.107-112

М.Н.Лебедева. Руководство к практическим занятиям по медицин ской микробиологии, М., 1973, с.136-143


Дополнительная литература:

Словник по мікробіології, вірусології, імунології та інфекційним захворюванням. Заг. ред. проф. Палій, К., 2004.


1.5. Ориентировочная основа действий (ООД)

Использование РА в диагностике инфекционных болезней:

Исследуемый материал

Чистая культура возбудителя

Сыворотка крови больного

РА на стекле со специфическими видовыми, типовыми, агглютинирующими сыворотками

Развернутая РА с разведениями сыворотки больного 1:50-1:1600 со специфическими диагностикумами

Конечный результат Конечный результат

через 10-15 мин. через 18-20 час.


1.6. Система обучающих заданий.


1.6.1. Укажите компоненты, необходимые для постановки развернутой реакции агглютинации:

A – сыворотки крови больного

B – физиологический раствор

C – чистая культура бактерий

D – известная иммунная неадсорбированная сыворотка

E – взвесь эритроцитов

F – диагностикум

G – комплемент

Правильный ответ: А, B, F


1.7. Методичкие указания для работы студентов на лабораторном занятии.


1.7.1. Методика проведения занятия.

Реакция агглютинации (РА) широко используется в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. Ее применяют как для идентификации возбудителя с помощью диагностических агглютинирующих сывороток, так и для определения антител в сыворотке крови больного по известным антигенам (диагностикумам).

С целью идентификации бактерий ставят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле. Для этого в каплю диагностической агглютинирующей сыворотки вносят петлей выделенную культуру и перемешивают. Сопроводжается РА контролем – в каплю физраствора добавляют выделенную бактериальную культуру. Наблюдают за появлением зерен агглютината в опыте, в контроле – помутнения.

Для выявления антител в сыворотке больного к ее разведениям (1:50-1:1600) добавляют известный диагностикум и помещают в термостат (37^оС) на 18-24 часа. Затем определяют титр антител по появлению зерен или хлопьев агглютината в разведениях сыворотки, в контроле диагностикума – равномерное помутнение, в контроле сыворотки – жидкость прозрачная.

Наиболее специфическая реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) широко применяется для выявления специфических антител в сыворотке крови больного при вирусных и других инфекционных заболеваниях. Для этого используют стандартный эритроцитарный диагностикум, добавляемый к разведениям сыворотке больного в лунки планшета. Инкубируют в термостате (37^оС) и производят первичный учет через 2 часа, окончательный – через 18-20 часа. Положительная РПГА выражается в появлении на дне лунок крыхлого осадка в виде зонтика, отрицательная – осадок в виде компактного диска с ровными краями.


Порядок выполнения лабораторной работы:

1. Поставить и учесть результат ориентировочной реакции агглютинации на стекле с целью идентификации выделенной культуры бактерий.

2. Поставить развернутую реакцию агглютинации с целью серологической диагностики инфекционного заболевания.

3. Учесть реакцию пассивной гемагглютинации в демонстрационном опыте.

4. Ознакомиться с биопрепаратами для РА и РПГА.


1.7.2. Организационная структура проведения лабораторного занятия.

№ этапа	Этапы работы	Время	Средства обучения	Оборудование	Место проведения
1	Проверка присутствующих	2	Диагностические агглютинирующие сыворотки Сыворотка больного Физиологический раствор Таблицы	Предметные стекла Пипетки1 мл Пробирки Штатив	Учебная лаборатория
2	Проверка первичного уровня знаний	10
3	Опрос студентов по теме занятия	20
4	Тестовый контроль	10
5	Лабораторная работа	40
6	Подведение итога занятия	5
7	Задание по следующей теме	3

Автор: доцент, кандидат биологических наук А.А.Чеснокова


Методическая разработка

по подготовке и работе на лабораторном занятии №17

для студентов медицинского факультета.


Тема: Серологические реакции. Реакция преципитации.

2. Актуальность темы.
   

Обусловлена высокой чувстивительностью реакции преципитации и широким испотльзованием ее в медицине и биологии.


1.2. Цели изучения темы.


1.2.1. Цель общая.

Освоить принцип и назначение реакции преципитации.


1.2.2. Цель конкретная.

Овладеть техникой постановки реакции кольцепреципитации и уметь использовать ее для диагностики инфекционных болезней.


1.3. Обеспечение исходного уровня знаний-умений:

1. Полноценные и неполноценные антигены (гаптены, полугаптены).

2. Корпускулярные и растворимые антигены.

3. Принцип взаимодействия антигенов и антител.


1.3. Тесты на исходный уровень знаний-умений:


1.3.1. Назовите основные свойства и признаки полноценного антигена:

A – белок

B – углеводы

C – является низкомолекулярным соединением

D – не растворим в жидкостях организма

E – вызывает образование антител в организме

F – не способен вступать в реакцию со специфическими антителами

G – растворим в жидкостях организма

H – имеет коллоидную структуру

Правильный ответ: A, E, G, H


1.4. Содержание занятия.

Реакция преципитации (РП) состоит в осаждении (преципитации) антигена (преципитиногена), находящегося в дисперстном коллоидном состоянии под воздействием специфических антител (преципитинов) в растворе электролита. РП применяется для диагностики инфекционных заболеваний (сибирская язва, туляремия), в судебно-медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белка (кровь, сперма) и в санитарной практике для определения фальсификации продуктов. РП обладает высокой специфичностью и чувствительностью. Преципитигеногеном могут быть белки животного, растительного и микробного происхождения, фильтраты культур бактерий или тканей, пораженных ими. РП ставят в различных модификациях: кольцепреципитации, в геле, для тонких иммунологических исследований применяется иммуноэлектрофорез, основанный на разделении антигенного комплекса в электрическом поле в присутствии специфических иммунных сывороток.


1.4.1. Граф логической структуры РП.

Материал для исследования: коллоидный растворимый антиген, экстрагированный из патологического материала РП ставится в узких пробирках со специфической преципитирующей сывороткой путем наслаивания.

Конечный результат через 1-2 мин.


1.4.2. Перечень теоретических вопросов:

1. Гаптены, их свойства.

2. Характеристика преципитиногенов и преципитинов.

3. Механизм взаимодействия преципитиногенов и преципитинов, их получение и использование.

4. Методические варианты РП: кольцепреципитации, РП в геле, иммуноэлектрофорез (РИЭФ).

5. Практическое использование РП в медицине и биологии.


1.4.3. Источники учебной информации.

Основная литература:

К.Д.Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. Мікробіологія, 1992, с.177-178

К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, 1980, с.197-200

В.Д.Тимаков. Микробиология, 1983, с.220-221

А.И.Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, Санкт-Петергбург, 2002, с.232-233

И.Л.Дикий, И.Ю.Халупяк, Н.Е.Шевелева, М.Ю.Стегний. Микробиология, Харьков, 1999, с.114-115

О.І.Клименюк, І.О.Ситник, М.С.Творко, В.П.Широбоків. Практична мікробіологія, 2004, с.137-141

Л.Б.Борисов. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, М., 1984, с.112-118

М.Н.Лебедева. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, М., 1973, с.102-106

Ю.С.Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и диагностике инфекционных болезней, 1986, с.31-32


Дополнительная литература:

Словник по мікробіології, вірусології, імунології та інфекційним захворюванням. Заг. ред. проф. Палій Г.К., 2004, с.107


1.5. Ориентировочная основа действий (ООД)

Использование РП в диагностике инфекционных заболеваний, санитарии, судмедэкспертизе:

Исследуемый материал

Экстракт из возбудителей, вытяжка из инфицированных органов, стенно-мозговая жидкость больных, смыв кровяных пятен, пищевые продукты

Культуры возбудителей, продуцирующие экзотоксин

РП кольцепреципитации с специфическими сывовотками

РП в геле, иммуноэлекрофорез

Конечный результат Конечный результат

через 5-10 мин. через 18-20 час.


1.6. Система обучающих заданий.


1.6.1. Укажите основные свойства и признаки преципитиногена:

A – являются гаптеном

B – являются микробной клеткой

C – является полноценным антигеном

D – является экзотоксином

E – является экстрактом бактерій

Правильный ответ: A, D, E


1.7. Методические указания для работы студентов на лабораторном занятии.


1.7.1. Методика проведения занятия.

Реакция преципитации (РП) высокоспецифичная и чувствительна. Используют для выявления антигенов в исследуемом материале. РП применяют в микробиологии, санитарии и гигиене, судебной медицине для выявления антигенов в исследуемом материале. В микробиологии РП наиболее часто проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстраперованными из патологического материала, чистых культур бактерий. В реакции используют диагностические преципитирующие сыворотки. Варианты постановки РП: кольцепреципитации, в геле (агаре), иммуноэлектрофорез (ИЭФ).

При постановке РП кольцепреципитации используют диагностические преципитирующие сыворотки, к которым осторожно по стенке пробирки наслаивают исследуемый раствор антигена. Учет реакции проводится через 1-2 мин. Положительный результат выражается в появлении преципитации в виде белого кольца на границе между сывороткой и исследуемым антигеном.

РП в геле ставят используя лунки, вырезанные в агаре: в центральную вносят диагностическую сыворотку, в периферические – исследуемый материал. Положительный результат проявляется в виде тонких мутных линий.

Иммуноэлектрофорез проводится в 2 этапа: I – электрофоретическое разделение исследуемого материала в агаре; II – иммунологический анализ. В агаре вырезают траншеи, в которые вносят иммунную сыворотку, содержащую антитела к исследуемым антигеном, в лунки – исследуемый материал. В случае положительной реакции формируется преципитат в виде тонких дуг.


Порядок выполнения лабораторной работы:

1. Поставить реакцию кольцепреципитации для выявления термопреципитиногена возбудителя в исследуемом материале с помощью известной диагностической сыворотки.

2. Познакомиться с методикой постановки и результатами РП в геле в демонстрационном опыте.


1.7.2. Организационная структура проведения лабораторного занятия.

№ этапа	Этапы работы	Время	Средства обучения	Оборудование	Место проведения
1	Проверка присутствующих	2	Штативы с учетом развернутой реакции агглютинации Нормальная сыворотка Преципитирующая сыворотка Преципитиноген в пробирках Таблицы по теме	Пастеровские пипетки Преципита-ционные пробирки	Учебная лаборатория
2	Проверка исходного уровня знаний (тестовый контроль)	15
3	Усный опрос студентов по теме занятия	20
4	Тестовый контроль знаний по теме занятия	15
5	Лабораторная работа	30
6	Подведение итогов, оценка работы каждого студента	6
7	Задание для самостоятельной работе при изучении следующей темы занятия	2

Автор: доцент, кандидат биологических наук А.А.Чеснокова


Методическая разработка

по подготовке и работе на лабораторном занятии №18

для студентов медицинского факультета.


Тема: Серологические реакции. Реакция связывания комплемента.

3. Актуальность темы.
   

Реакция связывания комплемента (РСК), являясь высоко специфической, широко используется в диагностике спирохетозов, риккетсиозов, микоплазмозов, вирусных и других инфекционных заболеваний.


1.2. Цели изучения темы.


1.2.1. Цель общая.

Уметь использовать РСК для диагностики инфекционных заболеваний.


1.2.2. Цель конкретная.

1. Освоить механизм РСК.

2. Овладеть техникой постановки и учетом РСК для серодиагностики инфекционных заболеваний.


1.3. Обеспечение исходного уровня знаний-умений:

1. Принцип и механизмы реакций иммунитета.

2. Специфические реакции организма на антиген.

3. Иммунохимические основы взаимодействия антител с антигенами.


1.3. Тесты на исходный уровень знаний-умений:


1.3.1. Взаимодействие антител с антигенами характеризуются:

A – быстрым соединением детерминантных групп

B – медленным соединением детерминантных групп

C – обратимостью реакции и легкостью элюции

D – необратимостью реакции и трудностью элюции

E – виделением небольшого количества энергии

Правильный ответ: В, C, E


1.4. Содержание занятия.

Реакция связывания комплемента (РСК) состоит их 2 систем: антиген + антитело + комплемент (І система), взвесь эритроцитов + гемолитическая система (ІІ система). Протекает в 2 фазы: І-специфическая – обусловливает связывание комплемента в случае соответствия антител и антигена, при несоответствии – антиген остается свободным. При введении в опыт II индикаторной системы гемолиз произойдет только при наличии свободного комплемента (реакция отрицательная). В случае, если комплемента адсорбировался на системе антиген-антитело, гемолизе не будет (реакция положительная).

РСК высоко чувствительна и специфична, применяют в диагностике бактериальных, риккетсиозных, вирусных и микоплазменных заболеваний.


1.4.1. Граф логической структуры РСК.

Материал для исследования: сыворотка крови больного.

Постановка РСК с сывороткой крови больного и специфическим диагностикумом, используя индикаторную гемолитическую систему.


1.4.2. Перечень теоретических вопросов:

1. Характеристика антигенов в РСК.

2. Характеристика комплементсвязывающих антител.

3. Природа комплемента.

4. Участие комплемента в реакциях иммунитета.

5. Гемолитическая система, ее роль в РСК.

6. Механизм, техника постановки и учет результатов РСК.

7. Практическое использование РСК.


1.4.3. Источники учебной информации.

Основная литература:

К.Д.Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. Мікробіологія, 1992, с.180

К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, 1980, с.173-181, 200-202

В.Д.Тимаков. Микробиология, 1983, с. 188-189, 200-202

А.И.Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, Санкт-Петергбург, 2002, с.234-235

И.Л.Дикий, И.Ю.Халупяк, Н.Е.Шевелева, М.Ю.Стегний. Микробиология, Харьков, 1999, с.116

О.І.Клименюк, І.О.Ситник, М.С.Творко, В.П.Широбоків. Практична мікробіологія, 2004, с.141-145

Л.Б.Борисов. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, М., 1984, с.118-122

М.Н.Лебедева. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, М., 1973, с.143-152

Ю.С.Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и диагностике инфекционных болезней, 1986, с.47-55


Дополнительная литература:

Словник по мікробіології, вірусології, імунології та інфекційним захворюванням. Заг. ред. проф. Палій Г.К., 2004, с.105-106, 248


1.5. Ориентировочная основа действий (ООД)


Использование РСК в диагностике инфекционных заболеваний:

Материал для исследования

Сыворотка крови

Метод исследования

Серологический

Р С К

Конечный результат

через 18-24 час.


1.6. Система обучающих заданий.


1.6.1. Укажите ингредиенты, необходимые для постановки РСК:

A – дистилированная вода

B – физиологический раствор

C – комплемент

D – сыворотка крови больного

E – чистая культура возбудителя

F – токсины бактерий

G – гемолитическая система

H – диагностикум

Правильный ответ: В, C, D, G, H


1.7. Короткие методические указания для работы студентов на лабораторном занятии.


1.7.1. Методика проведения занятия.

Постановка РСК с целью выявления антител в сыворотке больного с помощью оттитрованных антигена и компонента в рабочих дозах. Опыт сопровождается 2 контролями – сыворотки (физраствор, сыворотка, комплемент) и антигена (физраствор, антиген, комплемент). Одновременно готовится индикаторная система. Обе системы выдерживаются в термостате 40минут, после чего к основному опыту и контролям добавляется индикаторная система. Повторно реакция выдерживается в термостате до появления гемолиза в контролях. РСК считается положительной при задержке гемолиза в опытной пробирке.


1.7.2. Организационная структура проведения лабораторного занятия.

№ этапа	Этапы работы	Время	Средства обучения	Оборудование	Место проведения
1	Проверка присутствующих	2	Комплект ингредиентов для постановки РСК (антиген, комплемент, эритроциты, гемолитическая сыворотка) Физраствор Сыворотка больного Таблицы	Штативы, пробирки, пипетки	Учебная лаборатория
2	Проверка первичного уровня знаний (тестовый контроль)	10
3	Опрос студентов по теме занятия	20
4	Тестовый контроль знаний по теме занятия	40
5	Лабораторная работа	10
6	Подведение итогов, оценка работы каждого студента	5
7	Задание для самостоятельной работы внеаудиторного изучения следующей темы	3

Автор: доцент, кандидат биологических наук А.А.Чеснокова


Методическая разработка

по подготовке и работе на лабораторном занятии №19

для студентов медицинского факультета.


Тема: Реакции с использоанием меченых антигенов и антител.

4. Актуальность темы.
   

Широкое использование иммунофлюоресцентного, радиоиммунного и иммуноферментного методов обусловлена высокой чувствительностью, возможностью выявления широкого круга биологических веществ.


1.2. Цели изучения темы.


1.2.1. Цель общая.

Освоть принципы, механизмы и назначение иммунофлюоресцентного, радиоиммунного и иммуноферментного методов в диагностике.


1.2.2. Цель конкретная.

Оволадеть техникой постановки иммуноферментного метода (ИФА). Уметь интерпретировать результаты иммунофлюоресцентного прямого и непрямого метода, а также ИФА.


1.3. Обеспечение исходного уровня знаний-умений:

1. Корпускулярные и растворимые антигены.

2. Принципы серологической диагностики инфекционных заболеваний.

3. Серологическая идентификация возбудителей, как один из основных методов исследования микроорганизмов.


1.3. Тесты на исходный уровень знаний-умений:


1.3.1. Назовите специфические и неспецифические факторы гуморального иммунитета:

A – эритрин

B – С-реактивный белок

C – тромбоцитоактивирующий фактор

D – интерлейкины

E – гаммаглобулины

F – лейкоциты

G – простогландины

Правильный ответ A, B, C, D, E, G.


1.4. Содержание занятия.

Реакции, в которых участвуют меченые антигены или антитела (иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы) по своей чувствительности превосходят все серологические реакции.

Реакция иммунофлюоресценции Кунса (РИФ) позволяет обнаружить микробные антигены в патологическом материале с помощью меченых флюорохромами диагностических сывороток. При наличии специфических антигенов диагностической сыворотки в люминисцентном микроскопе выявляют свечение (прямой метод).

В непрямом методе вначале антиген связывают с обычным антителом, а затем этот комплекс обрабатывают меченым антиглобулином, который соединяется с ним. Образующийся комплекс легко обнаруживают по свечению в люминисцентном микроскопе.

В радиоиммунном методе (РИМ) используют очищенные и концентрированные антигены и антитела, меченные радиоизотопом. РИМ применяется для выявления как антигенов, так и антител. Для выявления антител к исследуемой сыворотке добавляют определенное количество меченого антигена. Для выявления антигена к исследуемому материалу добавляют специфическую диагностическую сыворотку, а затем – гомологичный меченый антиген. Если меченый антиген остается свободным – реакция положительная.

Иммуноферментный метод (ИФМ) используется выявления антигенов и антител с применением твердофазных носителей (полистероловые и поливиниловые пластины). Для выявления антител используют пластины, на дне которых находятся фиксированные антигены и добавляют исследуемую сыворотку. Затем (после промывки буфером) обрабатывают антисывороткой (антиглобуменом), меченой ферментом. Для выявления фермента используют Н₂О₂ и индикатора.

ИФМ находит широкое применение при вирусных инфекционных заболеваниях.


1.4.1. Граф логической структуры реакции иммунофлюоресценции (РИФ).

Исследуемый материал: патологический материал, содержащий бактериальные или вирусные антигены.

Постановка прямой РИФ (метод Кунса) с диагностическими специфическими флюоресцирующими сыворотками.

Постановка непрямой РИФ сопровождается использованием флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки, содержащей антитела только против кроличьих глобулинов.


2. Граф логической структуры иммуноферментного метода (ИФМ).

Постановка ИФМ с целью выявления антигенов или антител с использованием пластиковых (полистироловых) панелей с адсорбиванными на дне лунок антител или антигенев.


1.4.2. Перечень теоретических вопросов:

1. Иммунофлюоресцентный метод, феномены, лежащие в его основе.

2. Методические варианты реакции иммунофлюоресценции (РИФ): прямой и непрямой методы Кунса.

3. Техника постановки и диагностическое использование РИФ.

4. Радиоиммунологический анализ (РИА), его принцип и назначение.

5. Иммуноферментный анализ (ИФА). Твердофазный иммуноферментный метод. Его принцип и механизм взаимодействия ингредиентов.

6. Иммуноблотинг. Этапы иследования.

7. Использование ИФА и иммуноблотинга в диагностике инфекционных заболеваний.


1.4.3. Источники учебной информации.

Основная литература:

К.Д.Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. Мікробіологія, 1982, с.182

К.Д.Пяткин, Ю.С.Кривошеин. Микробиология, 1980, с.204

В.Д.Тимаков. Микробиология, 1983, с.223-225

А.И.Коротяев, С.А.Бабич. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, Санкт-Петергбург, 2002, с.233

И.Л.Дикий, И.Ю.Халупяк, Н.Е.Шевелева, М.Ю.Стегний. Микробиология, Харьков, 1999, с.116-118

О.І.Клименюк, І.О.Ситник, М.С.Творко, В.П.Широбоків. Практична мікробіологія, Тернопіль, 2004, с.145-146

Л.Б.Борисов. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, М., 1984, с.112-115

Ю.С.Кривошеин. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии и диагностике инфекционных болезней, 1986


Дополнительная литература:

Словник по мікробіології, вірусології, імунології та інфекційним захворюванням. Заг. ред. проф. Палій Г.К., 2004, с.59-60, 119

Посібник з медичної вірусології. Заг. ред. В.М.Гиріна, К., 1995, с.99-110


1.5. Ориентировочная основа действий (ООД)

1. Использование ИФМ для обнаружения антигенов и антител:


Выявление антител

Антиген (АГ) + Антитела (АТ) (сыворотка больного)

		+ Антиглобулиновая сыворотка с ферментом (АГСФ)
	АГ + АТ

		+ Н2О2 + ортофенилдиамин (ОФД)
	АГ + АТ + АГСФ

окончательный ответ

Выявление антигенов

Антитела (АТ) + Антиген (АГ) (исследуемый материал)

		+ Антиглобулиновая сыворткатка с ферментом (АГСФ)
	АТ + АГ

		+ Н2О2 + ортофенилдиамин (ОФД)
	АТ + АГ + АГСФ

окнчательный ответ

2. Использование иммунофлюоресценции в диагностике инфекционных заболеваний:

Прямой метод (метод Кунса)

Антиген (АГ)	+	Антитела (АТ) (специфические флюоресцирующие)			Светящийся комплекс
				АГ + АТ

Непрямой метод

Антигены (АГ) + Антитела (АТ)

		+ Антиглобулиновая сыворотка (АГС)
	АГ + АТ

		+ Светящийся комплекс
	АГ + АТ + АГС

1.6. Система обучающиих заданий.


1.6.1. Широкое распространение в вирусологических исследованиях получил ИФА. С какой целью в диагностике вирусных инфекций используется ИФА:

A – для выявления специфических антигенов

B – для выявления специфических антител

C – для определения титра антител

D – для выделения вируса

E – для определения агрегированных иммунной сывороткой вирионов

Прывильный ответ А, В


1.7. Короткие методические указания для работы студентов на лабораторном занятии.


1.7.1. Методика проведения занятия.

Ознайомится с принципом постановки метода иммунноферметного анализа с целью выявления специфических антител в сыворотке крови больного. В лунки планшета с адсорбированным на дне антигеном вносят по 1 капле исследуемой сыворотки и помещают в термостат (37^оС). Затем промывают буферным раствором и вносят по 1 капле меченые ферментом (пероксидазой хрена) антивидовые (антиглобулиновые сыворотки. Планшеты помещают в термостат (37^оС). Промывают лунки буферным раствором и вносят по 1 капле перекись водорода и ортофенилдиамин (ОФД). Помещают в термостот до появления желтого окрашивания в лунке с контрольной позитивной сывороткой.


1.7.2. Организационная структура проведения лабораторного занятия.

№ этапа	Этапы работы	Время	Средства обучения	Оборудование	Место проведения
1	Проверка присутствующих	2	Исследуемый материал Анти-глобулиновая сыворотка меченая ферментом Перекись водорода Буферный раствор	Планшеты с твердо-фазным носителем Пипетки	Учебная лаборатория
2	Проверка исходного уровня знаний (тестовый контроль)	15
3	Устный опрос студентов по теме занятия	20
4	Тестовый контроль знаний по теме занятия	15
5	Лабораторная работа	30
6	Подведение итогов, оценка работы каждого студента	6
7	Задание для самостоятельной внеаудиторной работы при изучении следующей темы	2