Geum.ru

Молекулярно-генетическая диагностика и дифференцированная терапия гистиоцитарных пролиферативных заболеваний у детей 14. 01. 08 педиатрия 14. 01. 21 гематология и переливание крови

Вид материалаАвтореферат

Содержание


Общая характеристика работы
Цель исследования
Prf1, unc13d, stx, stxbp, sh2d1a, xiap, rab27
BRAF в патогистологических образцах пациентов с гистиоцитозом из клеток Лангерганса. Оценить потенциальное место исследования му
Научная новизна
Prf1, unc13d, stx, stxbp, sh2d1a, xiap, rab27
Практическое значение
Основные положения, выносимые на защиту
UNC13D являются наиболее распространенным генетическим дефектом в популяции российских пациентов с ПГЛГ. Частота выявления мутац
Внедрение в практику
Апробация диссертации
Структура и объем диссертации
Содержание работы
Критерии диагноза.
Prf1, unc13d, stx, stxbp, sh2d1a
Определение статуса заболевания, критерии ответа на терапию и сроки оценки ответа
Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз
Гистиоцитоз из клеток Лангерганса
Иммуносупрессивная терапия
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток
...
Полное содержание
Подобный материал:
  1   2   3   4   5   6   7   8



На правах рукописи


Масчан Михаил Александрович


Молекулярно-генетическая диагностика и дифференцированная терапия гистиоцитарных пролиферативных заболеваний у детей


14.01.08 педиатрия

14.01.21 гематология и переливание крови


АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук


Москва 2011


Работа выполнена в ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» министерства здравоохранения и социального развития российской федерации


Научные консультанты:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Румянцев Александр Григорьевич

Доктор медицинских наук

Новичкова Галина Анатольевна


Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Алексеева Екатерина Иосифовна

Доктор медицинских наук, профессор Сметанина Наталья Сергеевна

Доктор медицинских наук, профессор Лукина Елена Алексеевна


Ведущая организация:

Санкт-петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П.Павлова


Защита диссертации состоится « » 2011 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.050.01 в ФГУ ФНКЦ ДГОИ по адресу – 117997, Москва, ул. Саморы Машела, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ ДГОИ


Автореферат разослан « » 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор В.М.Чернов


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы Гистиоцитарные пролиферативные расстройства, или гистиоцитозы, - группа редких заболеваний, морфологической основой которых является патологическая пролиферация клеток гистиоцитарного ряда: тканевых макрофагов, моноцитов, дендритных клеток и их предшественников. Согласно современной классификации гистиоцитарных заболеваний, выделяют гистиоцитозы с вариабельным клиническим течением, основными представителями которых являются гистиоцитоз из клеток Лангерганса (ГКЛ) и гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (ГЛГ), и злокачественные гистиоцитозы, к которым относят моноцитарные варианты острого миелобластного лейкоза, солидные опухоли из моноцитов и дендритных клеток и хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ) (современный термин - ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (ЮММЛ)) (B.Favara, 1998). Несмотря на различия в биологии этих заболеваний, рассмотрение гистиоцитозов как единой клинико-патологической группы обусловлено сходной клинической презентацией у детей раннего возраста, необходимостью дифференциальной диагностики и аналогией методов терапии. Настоящее исследование сосредоточено на принципиальных вопросах биологии, диагностики и терапии трех наиболее распространенных форм гистиоцитарных расстройств у детей: первичного гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза (ПГЛГ), ЮММЛ и ГКЛ.

ПГЛГ – врожденное расстройство иммунорегуляции, обусловленное генетическим дефектом механизмов клеточной цитотоксичности (G.Janka 2007, J-I.Henter 2002). Идентифицировано четыре гена, PRF1, UNC13D, STX и STXBP, герминальные мутации которых ведут к формированию клинического фенотипа ПГЛГ. Сходный клинический фенотип формируется у пациентов с Х-сцепленным лимфопролиферативным синдромом (Х-ЛПС) I и II типа и синдромом Грисселли, в основе которых лежат мутации в генах SH2D1A, XIAP и RAB27 соответственно (J.Pachlopnik Shmid, 2010). В отсутствие терапии ПГЛГ является смертельным заболеванием. Современная терапия ПГЛГ, основанная на последовательном применении иммуносупрессивной терапии (ИСТ) и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), позволяет излечивать около 50% пациентов (J-I.Henter, 2007). Своевременная верификация генетической природы ПГЛГ позволяет подтвердить показания к ТГСК, выполнить генетическое консультирование и пренатальную диагностику. Исследование генетической эпидемиологии ПГЛГ в популяции российских пациентов, анализ эффективности терапии ПГЛГ и разработка алгоритма клинической и лабораторной диагностики необходимы для улучшения диагностики и результатов лечения этого заболевания

ЮММЛ – заболевание, сочетающее черты миелодисплазии и миелопролиферации (M.Arico, 1997). В основе заболевания лежат соматические (реже - герминальные) мутации в генах PTPN11, NRAS, KRAS, CBL, NF1 (M.Loh, 2010). Результатом является гиперпролиферация миелоидных и моноцитарных предшественников, дисфункция костномозгового кроветворения и патологическая инфильтрация органов. Единственным методом, позволяющим излечивать пациентов с ЮММЛ, считается ТГСК. Выполнение ТГСК при ЮММЛ ассоциировано с 10-20% риском трансплантационной смертности и 30-40% риском рецидива заболевания (F.Locatelli, 2005). Нерешенным остается вопрос о месте нетрансплантационных методов терапии, таких как дифференцировочная терапия (ДТ) 13-цис-ретиноевой кислотой (13-RA) и высокодозная химиотерапия (ВХТ) (M.Loh, 2010). Разработка алгоритма молекулярно-генетического анализа и клинико-генетическое сопоставление необходимы для диагностики, определения показаний к ТГСК, мониторинга минимальной остаточной болезни и тестирования новых методик терапии. Анализ результатов ТГСК и альтернативной терапии необходим для оптимизации технологии ТГСК и определения перспективной тактики мультимодальной терапии.

ГКЛ – заболевание, в основе которого лежит клональная пролиферация миелоидных дендритных клеток, фенотипически сходных с эпидермальными клетками Лангерганса. Манифестация ГКЛ варьирует от локализованных очагов остеолизиса до диссеминированных форм с неконтролируемым злокачественным течением. Биологическая основа этих различий и природа ГКЛ в целом остаются нерасшифрованными (M.Egeler, 2010). Данные о роли мутации V600E в гене BRAF в патогенезе ГКЛ стали новым фактом, свидетельствующим в пользу неопластической природы заболевания (G.Badalyan-Very, 2010). Подтверждение этого факта может открыть новый этап понимания биологии заболевания и новые перспективы терапии. Современным стандартом лечения ГКЛ у детей является комбинированная терапия винбластином (Vbl) и преднизолоном (Prn) (M.Minkov, 2011). Одной из наиболее актуальных проблем является терапия пациентов группы «высокого риска» - пациентов с мультисистемным ГКЛ с вовлечением «органов риска» (МСОР+). Общая выживаемость в этой группе не превышает 70%, а в подгруппе пациентов, рефрактерных к стандартной терапии – 20% (M.Minkov, 2002, H.Gadner, 2001). В лечении резистентных форм ГКЛ наиболее перспективным представляется опыт интенсивной химиотерапии (ХТ) с использованием 2-хлор-дезоксиаденозина (2-CdA) в комбинации с цитозина арабинозидом (AraC) (F.Bernard, 2005). Таким образом, исследование молекулярного дефекта V600E BRAF при ГКЛ, анализ результатов терапии мультисистемного ГКЛ и разработка альтернативных программ терапии являются актуальным прикладным вопросом детской гематологии/онкологии и педиатрии.


Цель исследования

Разработка и внедрение современных принципов клинико-лабораторной и молекулярно-генетической диагностики и оптимизирующих программ терапии пациентов с первичным гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом, ювенильным миеломоноцитарным лейкозом и гистиоцитозом из клеток Лангерганса.

Задачи исследования
  1. Выполнить молекулярно-генетический анализ генов PRF1, UNC13D, STX, STXBP, SH2D1A, XIAP, RAB27 в группе российских пациентов с клиническим диагнозом ПГЛГ. Изучить клиническую презентацию и корреляцию генотип-фенотип при генетически детерминированном ГЛГ.
  2. Разработать алгоритм клинико-лабораторной диагностики, молекулярно-генетической верификации и дифференциальной диагностики первичного гемофагоцитарного синдрома и его генетических субвариантов.
  3. Провести анализ результатов лечения пациентов с ПГЛГ с использованием стандартных режимов программной иммуносупрессивной химиотерапии и алло-ТГСК. Разработать практические рекомендации по выбору тактики терапии.
  4. Выполнить молекулярно-биологический анализ генов PTPN11, NRAS, KRAS и CBL в репрезентативной группе пациентов с ЮММЛ. Сопоставить клинические и лабораторные проявления с генетическими дефектами и разработать рациональную тактику генетической верификации диагноза и алгоритм клинико-лабораторной диагностики и дифференциальной диагностики ЮММЛ.
  5. Провести анализ результатов алло-ТГСК, ВХТ и ДТ с использованием 13-RA и в группе пациентов с ЮММЛ. Разработать клиническую стратификацию на основании анализа клинических и лабораторных факторов риска. Разработать стратегию выбора терапии ЮММЛ в соответствии с клинико-биологичекой стратификацией.
  6. Исследовать мутацию V600E в гене BRAF в патогистологических образцах пациентов с гистиоцитозом из клеток Лангерганса. Оценить потенциальное место исследования мутационного статуса BRAF в диагностике, выборе и мониторинге терапии ГКЛ.
  7. Изучить непосредственные и отдаленные результаты стандартной терапии пациентов с ГКЛ. Разработать альтернативный подход к лечению пациентов с мультисистемным заболеванием на основе использования комбинированной ХТ 2-CdA и AraC. Провести сравнительный анализ результатов стандартной и альтернативной терапии. Разработать практические рекомендации по выбору терапии и тактике сопроводительной терапии ГКЛ в группе высокого риска.



Научная новизна

Впервые в репрезентативной выборке российских пациентов с ПГЛГ выполнено молекулярно-генетическое исследование всех известных генов ( PRF1, UNC13D, STX, STXBP, SH2D1A, XIAP, RAB27), ассоциированных с фенотипом ПГЛГ. Выявлено уникальное распределение генетических вариантов ПГЛГ с преобладанием FHL3, отличное от популяций с другим этническим составом. Показано, что распространение в популяции мутаций c.2346_2349del и c.3037insG обусловлено «эффектом основателя». Не выявлена значимая корреляция клинического фенотипа с генетическим вариантом ПГЛГ. В работе проведен первый в России анализ результатов терапии пациентов с ПГЛГ и убедительно продемонстрирована необходимость выполнения ТГСК всем пациентам с ПГЛГ. Показано, что основным препятствием к успеху ТГСК является высокая трансплантационная смертность (54 ± 15%). Впервые в репрезентативной выборке российских пациентов с ЮММЛ выполнено молекулярно-генетическое исследование основных генов (PTPN11, NRAS, KRAS и CBL), ассоциированных с развитием ЮММЛ. В работе подтверждено характерное распределение генетических вариантов ЮММЛ и впервые выявлена корреляция клинического фенотипа с генотипом заболевания. Разработана программа лечения 13-RA и низкими дозами AraC при ЮММЛ. Продемонстрирован клинико-гематологический эффект ДТ и установлена корреляция исходных клинико-лабораторных показателей и генетического варианта ЮММЛ с ответом на ДТ. Подробно описан феномен стойкого ответа на ДТ, выявлена персистенция мутантного клона у пациентов в статусе полного ответа (ПО) и описано развитие поздних злокачественных (острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) и аутоиммунных (тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП)) заболеваний у пациентов с ПО на ДТ. Впервые в репрезентативной группе российских пациентов проведен анализ результатов ТГСК, 5-летняя общая выживаемость составила 3813%, трансплантационная смертность - 2812%, частота развития рецидива 31%. Выполнен анализ мутации V600E BRAF у пациентов с ГКЛ и подтверждена вероятная роль данного соматического генетического дефекта в патогенезе ГКЛ у 24% пациентов. Разработана оригинальная программа терапии для группы пациентов «высокого риска» на основе использования комбинированной терапии 2-CdA и AraC. Показана высокая эффективность терапии рефрактерных форм МСОР+ ГКЛ, рОВ = 6615%. Показана высокая эффективность 2-CdA и AraC в лечении МСОР+ ГКЛ, рОВ = 889%, частота развития инвалидизирующих перманентных последствий – 0%. Описан необычный спектр инфекционных осложнений, включающий инфекции вакцинальным штаммом микобактерий M.bovis и тяжелые инфекции, вызванные респираторными вирусами.


Практическое значение

В работе на основании анализа генетической структуры ПГЛГ в группе российских пациентов разработан алгоритм клинико-лабораторной диагностики ПГЛГ, алгоритм молекулярно-гентического анализа и методика выявления наиболее распространенных мутаций в гене UNC13D. На основании анализа результатов ИСТ и ТГСК предложена стратегия выбора терапии, предусматривающая начало поиска донора в момент установления диагноза ПГЛГ и обязательное выполнение ТГСК не позднее 4 месяцев от момента установления диагноза. Разработан алгоритм молекулярно-генетического исследования при диагностике пациентов с клиническим диагнозом ЮММЛ, позволяющий верифицировать диагноз, осуществить рациональный выбор терапии и мониторинг заболевания после ТГСК. Разработан алгоритм выбора терапии в соответствии с клинико-биологической стратификацией пациентов. На основании анализа результатов ХТ и ТГСК предложена стратегия выбора терапии, предусматривающая начало поиска донора в момент установления диагноза ЮММЛ и обязательное выполнение ТГСК не позднее 6 месяцев от момента установления диагноза в группе пациентов, не ответивших на ДТ. Молекулярно-генетический анализ мутации V600E BRAF у пациентов с ГКЛ показал, что данная генетическая аномалия потенциально является диагностическим маркером заболевания и терапевтической мишенью. Разработана и внедрена в клиническую практику эффективная программа ВХТ на основе комбинации 2-CdA и AraC для лечения пациентов с рефрактерным течением ГКЛ МСОР+. Разработаны рекомендации по сопроводительной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту
  1. Гистиоцитарные пролиферативные расстройства – гистиоцитозы – группа фенотипически родственных заболеваний, в основе которых лежит спектр врожденных либо приобретенных молекулярных дефектов, ведущих к аномальной пролиферации и регуляции функциональной активности клеток гистиоцитарного ряда. Новые данные о биологии гистиоцитозов диктуют необходимость разработки комплексного алгоритма диагностики, дифференцированной тактики терапии и диспансерного наблюдения пациентов с гистиоцитозами.
  2. Мутации в гене UNC13D являются наиболее распространенным генетическим дефектом в популяции российских пациентов с ПГЛГ. Частота выявления мутаций в гене UNC13D составила 54%. Распространенность этих мутаций в исследованной группе обусловлена «эффектом основателя» - персистенцией в популяции мутаций c.2346_2349del и c.3037insG. Исследование гена UNC13D рекомендуется в качестве первого этапа молекулярно-генетической диагностики ПГЛГ в России.
  3. Единственным методом терапии, обеспечивающим долгосрочную выживаемость пациентов с ПГЛГ, является ТГСК. 5-летняя рОВ в группе ПГЛГ составляет 37±14 % при выполнении ТГСК, 0±0% при выполнении только ИСТ, р = 0,0005. Неудачи ТГСК обусловлены высокой трансплантационной смертностью, рTRM = 54±15%, Идентификация и выбор донора являются приоритетными задачами наравне с генетической верификацией диагноза и началом иммуносупрессивной терапии. ТГСК должна быть выполнена не позднее 4 месяцев от начала ИСТ, так как частота реактивации заболевания составляет 95%, медиана реактивации – 5 месяцев.
  4. Молекулярно-генетическое исследование генов PTPN11, NRAS, KRAS и CBL позволяет верифицировать диагноз у 70% пациентов с ЮММЛ. Относительная частота различных генетических дефектов составляет: PTPN11 - 35%, NRAS - 14%, CBL - 13%, KRAS - 11%. Стратификация пациентов на основании генетического варианта ЮММЛ (мутации в генах RAS и CBL), возраста манифестации (< 1 года) и содержания фетального гемоглобина (HbF) (< 10%) позволяет выделить прогностически благоприятную группу, не нуждающуюся в выполнении ТГСК в первой линии терапии. Пациентам этой группы показано проведение ДТ 13-RA + AraC, 5-летняя рОВ при проведении ДТ составляет 75±15%.
  5. Пациенты группы высокого риска и пациенты, не ответившие на терапию 13-RA + AraC, нуждаются в выполнении ТГСК по витальным показаниям не позднее 6 месяцев от установления диагноза. ТГСК должна быть выполнена независимо от наличия полностью совместимого донора. 5-летняя рОВ при выполнении ТГСК составила 38±13%. Применение флударабина (Flu) в комбинации с бусульфаном (Bu) и мельфаланом (Mel) обеспечивает эквивалентную частоту приживления трансплантата (90% и 60%, р = 0.24) и общую выживаемость (рОВ 47±19% и 33±19%, р = 0.72) в сравнении с стандартным режимом кондиционирования: циклофосфамид (Cy) + Bu + Mel.
  6. Мутация V600E BRAF выявляется у 24% пациентов с ГКЛ и, вероятно, принимает участие в патогенезе заболевания. Значимой корреляции статуса BRAF с клиническими и лабораторными проявлениями заболевания не выявлено. Мутация V600E BRAF потенциально является диагностическим маркером и терапевтической мишенью у пациентов с ГКЛ.
  7. Комбинированная ХТ 2-Сda и AraC является эффективным методом лечения мультисистемного ГКЛ, резистентного к стандартной терапии, рОВ = 66±19%. Применение 2-Сda и AraC в терапии первой линии МСОР+ ГКЛ более эффективно в сравнении со стандартной терапией. Частота достижения полных ответов составила 100% vs. 33%, рБСВ = 88±9% vs 40±11%, частота формирования перманентных осложнений, 66% vs 0%. Достоверных различий рОВ не выявлено, что обусловлено высокой эффективностью терапии второй линии. Применение ВХТ 2-Сda + AraC ассоциировано с выраженной миелосупрессией и иммуносупрессией и высоким риском развития инфекционных осложнений. Характер иммуносупрессии определяет спектр инфекций, включающий вирусные инфекции и инфекции вакцинальным штаммом M.bovis.



Внедрение в практику

Результаты работы внедрены в практику молекулярной диагностики ПГЛГ в Медико-генетическом научном центре РАМН (зав. лабораторией профессор А.В.Поляков) и диагностики ЮММЛ в лаборатории молекулярной биологии ФНКЦ ДГОИ (зав. лабораторией к.м.н. Бобрынина В.О.). Алгоритмы диагностики и оптимизированные протоколы терапии используются в отделениях гематологии и трансплантации костного мозга РДКБ и в клинике ФНКЦ ДГОИ. Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и семинаров по детской гематологии/онкологии ФУВ РГМУ им. Н.И. Пирогова

Апробация диссертации

Материалы диссертации представлены в докладах на национальных и международных конференциях, в частности на конференции международного общества по изучению гистиоцитозов (Histiocyte Society) в 2005, 2008, 2009 гг., международного общества детских онкологов (SIOP) в 2010 г., европейской ассоциации гематологии (EHA) в 2010 году, европейского общества генетики человека (ESHG) в 2008, 2009, 2010 гг., российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в 2011 году. Основные положения и выводы диссертации используются в курсе лекций и семинаров по детской гематологии/онкологии ФУВ РГМУ им. Н.И.Пирогова. Материалы диссертации опубликованы в составе 25 печатных работ, в том числе 10 в изданиях, рекоммендованых ВАК.

Апробация диссертации состоялась 15 марта 2011 г. на научно-практической конференции ФНКЦ ДГОИ.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен в 8 главах. Структура диссертации традиционна и включает разделы: введение, обзор литературы, пациенты и методы, результаты, обсуждение, выводы и практические рекоммендации. Объем диссертации составляет 400 страниц. Диссертация включает 40 рисунков и 35 таблиц.


Содержание работы

Пациенты и методы

Формирование выборки. В исследование включено 180 пациентов в возрасте от 1 месяца до 17 лет с диагнозом ПГЛГ, ЮММЛ и ГКЛ. В группу ПГЛГ включены 34 пациента из 31 семьи. Молекулярно-генетическое исследование выполнено 26 пациентам. Анализ результатов терапии выполнен в группе 32 пациентов, 2 пациента с верифицированным диагнозом Х-ЛПС были исключены. В группу ЮММЛ включен 61 пациент, молекулярно-генетическое исследование выполнено 44 пациентам, анализ результатов терапии выполнен во всей группе. В группу ГКЛ включены 86 пациентов, в анализ результатов терапии включены 48 пациентов, молекулярно-генетическое исследование выполнено 37 пациентам. Основу выборки составили все пациенты (n = 143) с соответствующим диагнозом, наблюдавшиеся в отделении общей гематологии РДКБ в период с 1993 по 2010 гг. Молекулярно-генетическое исследование ГКЛ выполнено на биоматериале пациентов из различных клиник, архивные образцы которых были доступны для анализа.

Критерии диагноза. Диагноз ПГЛГ и ЮММЛ устанавливали на основании международных критериев приведенных в табл. 1 и 2. Диагноз ГКЛ устанавливали в соответствии с рекомендациями The Histiocyte Society на основании гистологической картины и иммуногистохимической детекции маркера CD1a на патологических клеточных элементах. Клиническое стадирование пациентов с ГКЛ проводили в соответствии с рекомендациями The Histiocyte Society. В соответствии с числом пораженных органов и систем выделяли моносистемное (МоноС) заболевание и мультисистемное (МС) заболевание. При мультисистемном заболевании выделяли формы с вовлечением «органов риска» (МСОР+) и без такового (МСОР-). К «органам риска» относили печень, кроветворную систему, селезенку и легкие.

Обследование пациентов. Минимальный объем клинико-лабораторного обследования включал: 1) автоматический анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы; 2) биохимический анализ крови с определением АЛТ, АСТ, ЩФ, ЛДГ, билирубина, мочевины, креатинина, альбумина; 3) коагулограмму; 4) миелограмму с окраской гематоксилин-эозин; 5) иммуноглобулины сыворотки; 6) УЗИ брюшной полости; 7) рентгенографию грудной клетки; 8) общий анализ мочи. Дополнительный набор исследований для пациентов с ПГЛГ включал: 1) триглицериды сыворотки (натощак); 2) ферритин сыворотки; 3) исследование спинномозговой жидкости с определением цитоза, содержания белка, лейкоцитарной формулы цитопрепарата. Для пациентов



Таблица 1

Диагностические критерии гемофагоцитарного лимфогистиоцитоза, Histiocyte Society, 2004
  • Лихорадка

³ 38,50 > 7 дней
  • Спленомегалия

> 3 см из под края рёберной дуги
  • Цитопения

в ≥ 2-х линиях


  • гемоглобин < 90 г/л
  • тромбоциты < 100х109/л
  • нейтрофилы < 1 х109/л
  • Гипертриглицеридемия и/или гипофибриногенемия
  • триглицериды ³ 2,0 ммол/л
  • фибриноген £ 1,5 г/л
  • Ферритин

³500 мкг/л
  • sCD25 (sIL-2R)
³ 2500 Ед/л
  • Снижение цитотоксичности НК-клеток


  • Гемофагоцитоз в костном мозге, лимфатических узлах или селезенке



Для установления диагноза необходимо выполнение 5 из 8 критериев либо молекулярно-генетическая верификация диагноза.



с ЮММЛ: 1) электрофорез гемоглобина; 2) цитогенетическое/молекулярно-генетическое исследование костного мозга с целью выявления Ph-хромосомы/химерного транскрипта BCR-ABL; 3) культуральное исследование периферической крови с оценкой спонтанного колониеобразования гранулоцитарно-макрофагальных колоний. Для пациентов с ГКЛ включал: 1) пробу Зимницкого; 2) обзорную рентгенографию скелета или радиоизотопное исследование с Технецием-99; 3) биопсию патологического очага.

Молекулярно-генетическое исследование. В группе пациентов с ПГЛГ исследованы все экзоны генов, ассоциированных с клиническим фенотипом ПГЛГ: PRF1, UNC13D, STX, STXBP, SH2D1A и XIAP. В группе ЮММЛ для исследованы экзоны 3 и 13 гена PTPN11, 2 и 3 генов NRAS и KRAS, 8 и 9 гена CBL. Молекулярно-генетическое исследование ГКЛ было ограничено мутацией V600E BRAF. Прямое автоматическое секвенирование в группе ПГЛГ: геномную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора DNA Prep 100 Diatom TM из образцов периферической крови. Амплификацию фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). Прямое автоматическое секвенирование в группе ЮММЛ: геномную ДНК выделяли с помощью набора «ДНК-сорб-В», АмплиСенс, ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, Москва, Россия, из образцов периферической крови. Амплификацию фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере Dyad, BioRad. Все фрагменты секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator’s v 1.1 Cycle Sequencing Kit и анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA, США), анализ результатов проводили с

Таблица 2

Критерии диагностики ювенильного миеломоноцитарного лейкоза [M.Loh, 2010]
  1. Обязательные клинические и гематологические критерии
  • Содержание моноцитов периферической крови >1,0х109/л
  • Содержание бластов в крови и костном мозге < 20%
  • Спленомегалия
  • Отсутствие Ph-хромосомы или химерного транскрипта BCR-ABL
  1. Генетическое верификация
  • Соматическая мутация гена PTPN11 или RAS или CBL
  • Мутация гена NF1 или клинический диагноз нейрофиброматоза I типа
  • Моносомия 7
  1. Дополнительные лабораторные критерии
  • Спонтанный рост гранулоцитарно-макрофагальных колоний из мононуклеаров периферической крови или гиперчувствительность к ГМ-КСФ
  • Повышенное содержание HbF
  • Циркуляция незрелых гранулоцитов в периферической крови
  • Лейкоциты > 10х109/л
  • Клональная цитогенетическая аномалия, отличная от моносомии 7

Диагностическое правило: необходимо выполнение всех критериев группы I и одного из критериев группы II. При отсутствии критериев группы II, необходимо выполнение двух критериев группы III.



помощью программы ChromasPro. При исследовании гаплотипа основателя для повторяющихся мутаций в гене UNC13D были выбраны 8 микросателлитных маркеров на хромосоме 17q25, в области размером 7,4 млн.п.н. вокруг исследуемого гена. Для каждого из маркеров были выбраны и пары праймеров. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с окрашиванием раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью системы GelDoc, BioRad, США. Выделение клеточных линий из нуклеарной фракции периферической крови проводили реагентами для иммуномагнитной селекции производства Dynal, Invitrogen, США, в соответствии с инструкцией производителя. Исследование мутации V600E BRAF при ГКЛ: ДНК выделялась из биоптатов, фиксированных и залитых в парафин, после макродиссекции. После депарафинизации ксилолом и проводки по спиртам проводилась инкубация с протеиназой К в течение ночи и фенол-хлороформная экстракция. Для выявления мутации проводилась ПЦР в реальном времени с использованием флюоресцентных зондов TaqMan. Дизайн праймеров проводился таким образом, чтобы избежать неспецифической амплификации псевдогена на Х хромосоме. Зонд, специфичный к нормальной последовательности гена был помечен флуорофором FAM на 5’ конце, специфичный мутантной последовательности – HEX. Для повышения чувствительности метода в нуклеотидный состав обоих зондов были введены LNA (locked nucleic acids). Амплификация проводилась на приборе CFX-96, BioRad. Данные флюоресценции анализировались с помощью программы аллельной дискриминации. Все образцы амплифицировались отдельно с использованием другой пары праймеров, после чего выполнялось прямое секвенирование на приборе AB3500, Applied Biosystems.

Определение статуса заболевания, критерии ответа на терапию и сроки оценки ответа

Первичный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз Частичный ответ (ЧО) – отсутствие лихорадки >37,7oC, сокращение размеров селезенки, тромбоциты >100х109/л, фибриноген > 1,5 г/л. Полный ответ (ПО) – отсутствие лихорадки >37,7oC, нормальный размер селезенки, нормализация показателей периферической крови (гемоглобин >100г/л, тромбоциты >100х109/л, нейтрофилы >0,5х109/л), триглицериды < 2 ммоль/л, ферритин < 500мкг/л, нормальные показатели СМЖ. Активное заболевание (АЗ) – пациенты, не выполняющие критерии ПО и ЧО. Реактивация заболевания (РЗ) - появление ≥3 признаков из 7 (лихорадка >38,5oC, тромбоциты <100х109/л, спленомегалия, триглицериды >2 ммоль/л, фибриноген <1,5 г/л, гемофагоцитоз, ферритин > 500мкг/л) после достижения ПО или ЧО. Появление неврологического дефицита или характерных изменений состава спинномозговой жидкости (СМЖ) достаточно для констатации реактивации заболевания. Ответ на ИСТ оценивали через 2 месяца от начала лечения.

Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз Общепринятых критериев оценки ответа на терапию при ЮММЛ не существует. В настоящей работе были приняты следующие определения статуса заболевания: полный ответ (ПО) - разрешение всех клинических и лабораторных проявлений заболевания, не поддерживаемое терапией в течение > 1 месяца.Частичный ответ (ЧО) – лейкоциты < 10x109/л, тромбоциты > 100x109/л, гемоглобин > 100 г/л, сокращение размеров печени (≤ 3 см из-под ребра) и селезенки (≤ 3 см из-под ребра), отсутствие специфической инфильтрации другой локализации. Отсутствие бластемии. Стабилизация заболевания (СЗ) – снижение лейкоцитоза на ≥ 50% от исходного, повышение уровня тромбоцитов на ≥ 50% от исходного, сокращение размеров печени и селезенки на ≥ 50% от исходного. Прогрессия заболевания (ПЗ) - сохранение лабораторных и клинических проявлений заболевания при невыполнении условий СЗ. Совокупно ПО и ЧО рассматривался как клинически значимый ответ, СЗ и ПЗ как отсутствие ответа. Ответ на терапию оценивали не ранее, чем через 2 месяца от начала терапии.

Гистиоцитоз из клеток Лангерганса Полный ответ (ПО) – разрешение всех обратимых клинических и лабораторных проявлений заболевания. Частичный ответ (ЧО) – неполное разрешение исходных клинических и лабораторных проявлений заболевания. Прогрессия заболевания (ПЗ) - появление новых очагов поражения и/или сохранение и/или ухудшение со стороны исходных очагов/клинико-лабораторных проявлений. Перманентные осложнения – необратимые изменения, развившиеся вследствие поражения органа/ткани ГКЛ: несахарный диабет, фиброз легких, фиброз/цирроз печени, гипопитуитаризм. Реактивация заболевания (РЗ) – появление клинических и лабораторных признаков заболевания после констатации достижения ПО. Сроки оценки ответа – ответ на терапию оценивался по завершении интенсивной фазы терапии (6 недель и 12 недель при терапии по стандартным протоколам) или после каждого блока ВХТ (пилотный протокол).

Терапия

Первичный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз

Терапию ПГЛГ проводили в соответствии с рекомендациями протокола HLH-94 (n=24) и HLH-2004 (n=5), 3 пациента получили сопроводительную терапию. Терапия состояла из ИСТ и ТГСК.

Иммуносупрессивная терапия В состав ИСТ был включен этопозид (VP-16), дексаметазон (Dexa), циклоспорин А (CsA), метотрексат (MTX)(эндолюмбально) и Prn (эндолюмбально). Рис. 1. При развитии реактивации заболевания назначали ИСТ второй линии по выбору врача. Антитимоцитарный глобулин (АТГ), АТГАМ, Пфайзер, США в дозе 160 мг/кг/курс, получили 2 пациента. Комбинированную ВХТ в составе Тиофосфамид (TT) 2 мг/кг, винкристин (Vcr) 1,5 мг/м2, флударабин (Flu) 150 мг/м2, Prn 5 мг/кг/сутки получили 4 пациента. Циклофосфамид (Cy) в дозе 500 мг/м2 получили 2 пациента. Повторную терапию элементами стандартного протокола получили 12 пациентов.*

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток ТГСК выполнена 12 пациентам. Восьми пациентам проводили миелоаблативное кондиционирование, 4 пациентам – кондиционирование со сниженной интенсивностью. У 3 пациентов ТГСК выполнена от HLA-совместимого сиблинга (MSD), у 7 пациентов – от HLA-совместимого неродственного донора (MUD), у 2 пациентов – от частично совместимого родственного донора (MMRD). Профилактику реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) проводили ингибитором кальциневрина (CsA, n = 7 или такролимус (Tacro), n = 4) в комбинации с MTX (n = 3) или мофетила микофенолятом (MMF) (n = 7). Один пациент получал MTX и MMF. У 1 пациента для профилактики РТПХ выполнили селекцию CD34+-клеток на приборе CliniMacs, Miltenyi Biotec, Германия. Детали процедуры трансплантации представлены в табл.3.

Рисунок 1

Схема терапии ПГЛГ в соответствии с протоколом HLH-2004



Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз

В первой линии терапии пациенты с ЮММЛ получали ДТ (n = 32) или ВХТ (n = 18), ТГСК (n = 1), сопроводительную терапию (n = 10).

Дифференцировочная терапия. ДТ включала 13-RA в дозе 100 мг/м2/сутки ежедневно в комбинации с AraC в дозе 10-30 мг/м2/сутки 10-14 дней каждого месяца. Дозу AraC корректировали для поддержания концентрации лейкоцитов в интервале 3-10х109/л.

Высокодозная химиотерапия. ВХТ проводили в соответствии со стандартными элементами программной терапии острых миелобластных лейкозов. Блоки FLA (Flu в дозе 30 мг/м2 №5, AraC в дозе 2000 мг/м2 №5), FLAM (FLA + митоксантрон (Mit) в дозе 10-12 мг/м2 №3), FLAIda (FLA + идарубицин (Ida) в дозе 8-10 мг/м2 №3), ADE ( AraC 200 мг/м2/сутки №7, даунорубицин (DNR) 45-60 мг/м2 №3, VP-16 150 мг/м2 №3), AraCVp (AraC 500 мг/м2/сутки №5, VP-16 100 мг/м2 №5), IFOVP-16 (ифосфамид (IFO) 2000 мг/м2/сутки №5, VP-16 100 мг/м2 №5), AME (AraC 200 мг/м2/сутки №7, Mit 10-12 мг/м2 №3, VP-16 100-150 мг/м2 №3), HAE (AraC 2000-6000 мг/м2/сутки №4, VP-16 100 мг/м2 №4). При достижении ПО или ЧО на ДТ пациенты продолжали получать ДТ терапию до развития рецидива ЮММЛ, развития других гематологических заболеваний либо решения о выполнении ТГСК. При отсутствии ответа на ДТ пациенты получали ВХТ в качестве терапии второй линии. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток Аллогенная ТГСК выполнена 20 пациентам. Семнадцать пациентов получили ТГСК в отделении трансплантации костного мозга РДКБ и включены в детальный анализ результатов ТГСК, 3 пациента трансплантированы в других клиниках и включены только в анализ выживаемости. Все пациенты получили миелоаблативное кондиционирование. У 5 пациентов ТГСК выполнена от MSD, у 8 пациентов – от MUD, у 4 пациентов – от MMRD. В качестве источника ГСК использовали КМ (n = 7), СКПК (n = 7, из них в 3 случаях проводили селекцию CD34+-клеток на приборе CliniMacs, Miltenyi Biotec, Германия), ПК (n = 3). Профилактику РТПХ проводили ингибитором кальциневрина (CsA, n = 10 или Tacro, n = 6) в комбинации с MTX (n = 1) или MMF (n = 8) или Prn (n = 1). Один пациент получал MTX и MMF. Детали ТГСК суммированы в табл. 4

Гистиоцитоз из клеток Лангерганса

Стандартная терапия первой линии. В период с 1994 по 2003 год пациенты получали терапию первой линии в соответствии с рекомендациями одного из стандартных международных протоколов: DAL-HX-90 (n = 4), LCH I (n = 5), LCH II (n = 18), LCH III (n = 7). Дозы и порядок введения препаратов представлены на рис. 2.

Терапия второй линии. В случае неудачи терапии первой линии выбор терапии второй линии осуществлялся индивидуально, так как общепринятого стандарта терапии второй линии не существовало. Терапия второй линии суммирована в табл. 5. Пять пациентов получили терапию с использованием комбинации 2-CdA и промежуточных доз AraC.

Таблица 3 характеристики процедуры трансплантации в группе пациентов с первичным гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом




Донор1
Совместимость
Источник2
NC, х108/кг
Кондиционирование3
Профилактика РТПХ4

18.GL3
UCB
8/10
ПК
0,8
Bu 19 мг/кг
Cy 120 мг/кг
Flu 100 мг/м2
Atgam 90 мг/кг
Tacro 0,03 мг/кг
MMF 30 мг/кг



29.GL32
UCB
8/10
ПК
3,4
Mel180 мг/м2



Flu 150 мг/м2
Thymo 10 мг/кг
Tacro 0,03 мг/кг
MMF 30 мг/кг
MTX4

31.GL2.1
MUD
10/10
СКПК
22
Bu 20 мг/кг
Cy 120 мг/кг
Flu 100 мг/м2
Atgam 90 мг/кг
CsA 3 мг/кг
MMF 30 мг/кг



4.GL
MUD
10/10
КМ
4,1
Bu 16 мг/кг
Cy 120 мг/кг
Flu 90 мг/м2
Atgam 90 мг/кг



MMF 30 мг/кг
MTX4

13.GL12
MUD
8/8
KM
8
Bu 20 мг/кг
Cy 200 мг/кг



Atgam 160 мг/кг
CsA 3 мг/кг
MTX 30 мг/кг

Prn 1 мг/кг

25.GL1
MUD
10/10
СКПК
12
Bu 20 мг/кг
Cy 120 мг/кг
Flu 100 мг/м2
Thymo 10 мг/кг

Tacro 0,03 мг/кг
MMF 30 мг/кг



28.GL10
MUD
10/10
СКПК
23
Bu 8 мг/кг
Cy 120 мг/кг
Flu 150 мг/м2
Atg-F 40 мг/кг
CsA 3 мг/кг
MMF 30 мг/кг
MTX4

2.GL27
MMRD
8/10
КМ
8,4
Mel 180 мг/м2
TT 10 мг/кг
Flu 150 мг/м2
Atgam 90 мг/кг
Tacro 0,03 мг/кг
MMF 30 мг/кг



17.GL11
MMRD
4/6
СКПК5
8
Bu 16 мг/кг

Cy 200 мг/кг
Flu 90 мг/м2
Atgam 90 мг/кг
CsA 3 мг/кг






21.GL9
MSD
6/6
СКПК
8,2
Bu 16 мг/кг
Cy 120 мг/кг
Flu 90 мг/м2
Atgam 90 мг/кг
CsA 3 мг/кг
MMF 30 мг/кг



14.GL8
MSD
6/6
СКПК
18
TT 15 мг/кг
Cy 15 мг/кг
Flu 90 мг/м2
Atgam 90 мг/кг
CsA 3 мг/кг






35GL
MSD
6/6
КМ
nd6
Bu 16 мг/кг
Cy200 мг/кг



Atgam 90 мг/кг
CsA 3 мг/кг








1 UCB - неродственная пуповинная кровь, MSD – совместимый сиблинг, MUD – неродственный совместимый донор, MMRD – родственный частично совместимый донор

2 ПК – пуповинная кровь, СКПК – стволовые клетки периферической крови, КМ – костный мозг

3 TT – тиофосфамид, Mel – мельфалан, Flu – флударабин, Bu – бусульфан, Thymo – тимоглобулин, Cy – циклофосфамид, Аtg-F – АТГ-Фрезениус,

ATGAM – атгам.

4 Tacro – такролимус, CsA – циклоспорин А, MMF – мофетила микофенолат, MTX– метотрексат, доза 15 мг/м2 день +3, 10 мг/м2 – день +6, +11, Prn –

преднизолон

5 СD34+ -селекция

6 nd- нет данных


Таблица 5

Терапия второй линии в группе пациентов с ГКЛ, не ответивших на стандартную терапию первой линии

№
Возраст, месяцев
Терапия


Статус через 6 недель
Альтернативная терапия (до 2-CdA)
Интервал до 2-CdA, дни
2-CdA-содержащие циклы терапии

1
5

LCH I

ПЗ
MP 30 мг/кг №3 – 2 блока
81
2CdA 6 мг/м2/сут N5, AraC 200 мг/м2/сут N5 - 2 блока

2
28
LCH II

ПЗ
-
37
2CdA 7 мг/м2/сут N5, DNR 45 мг/м2/сут N3;

2CdA 7 мг/м2/сут N5, AraC 1000 мг/м2/сут N5;

2CdA 7 мг/м2/сут N5, AraC 1000 мг/м2/сут N5 + Ida 8 мг/м2/сут N3

3
11,3
LCH II

ПЗ
-
46
2 CdA 8мг/м2/сут N5, AraC 1000 мг/м2/сут N5 – 4 блока

4
6,3

LCH II

ПЗ
-
60
2 CdA 7 (9)мг/м2/сут N5, AraC 1000 мг/м2/сут N5 – 3 блока

5
26

LCH II

ПЗ
MP 20 мг/кг №3; Cy 500 мг/м2+Винкристин (Vcr) 0,05 мг/кг №4; Инфликсимаб 4 мг/кг №1; MTX 500 мг/м2/24 часа + МР 20 мг/кг №3 + 6-МП; MTX 500 мг/м2/24 часа; FLAG

138
2 CdA 8(9)мг/м2/сут N5, AraC 1000 мг/м2/сут N5 – 3 блока (в 3 + Dauno 45 мг/м2/сут N2)

6
15
LCH II

ПЗ
Интенсивная фаза II (рукав В, Mtx+)
87
2 CdA 6 мг/м2/сут N5, AraC 1000 мг/м2/сут N5 – 3 блока

7
24
LCH II

ПЗ
-
29
2 CdA 6 мг/м2/сут N5, AraC 1000 мг/м2/сут N5 – 3 блока

9
5,2

LCH II

ЧО
VP16 100мг/м2 + МР 30 мг/кг №3 – 2 блока

-
-

10
4

LCH I

ПЗ
АТГ 25 мг/кг/курс; Cph 500 мг/м2 + DOXO 25 мг/м2; МР 30 мг/кг №3
-
-