Подготовка научных кадров по физико-химической биологии и биотехнологии
| Вид материала | Документы |
- Институт пищевой биотехнологии и геномики Национальной академии наук Украины, 2342.88kb.
- Рабочая программа по дисциплине Аналитическая химия и физико-химические методы анализа, 414.04kb.
- Курсовой или дипломной работы в отделе эволюционной биохимии нии физико-химической, 15.25kb.
- Образовательный стандарт специальность: 170500 [240801] «Машины и аппараты химических, 187.74kb.
- 2005 –№41 Рубрика: Проблемы подготовки, сохранения и развития кадров российской науки, 99kb.
- Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии, 481.05kb.
- Решение этих проблем непосредственно связано с изучением цитоэмбриологических, физиологических, 271.54kb.
- Основанное на научных исследованиях воспроизводство научных и педагогических кадров,, 229.69kb.
- Рабочая программа дисциплины компьютерные моделирующие системы в химической технологии, 239.63kb.
- Вопросы к зачету по курсу "Основы биотехнологии", 27.24kb.
Структурно-функциональные исследования ферментов нуклеинового обмена и их биотехнологическое применение
Группа технологии синтеза нуклеиновых кислот и их компонентов ФИБХ
Определены кинетические параметры мутантных форм дезоксирибонуклеозид монофосфаткиназы (dNMP-киназы) бактериофага Т5, содержащих единичные аминокислотные замены: - S13A, D16N, T17N, T17S, R130K, K131E, Q134A, G137A, T138A, W150F, D170N, R172I, E176Q. Удельная активность мутантных форм фермента была исследована на природных акцепторах фосфорильной группы (dAMP, dCMP, dGMP, dTMP).
Было показано, что замены заряженных аминокислот dNMP-связывающего домена – R130, R172, D170 и E176, - приводят к практически полной потере ферментативной активности. Очевидно, эти заряженные аминокислоты абсолютно необходимы для связывания и фосфорилирования всех четырех канонических dNMPs. Аргинины, вероятно, участвуют в связывании γ-фосфата донора и α- и β-фосфатов акцептора фосфорила.
Аминокислотные замены G137A, T138A и T17N ведут к резкому снижению активности на трех субстратах с сохранением достаточно высокой активности на четвертом (в случае треониновых мутантов - dAMP, а в случае G137A – dCMP). У мутанта Q134A сохраняется активность на dAMP и dCMP. Замены в АТP-связывающем сайте (S13A, D16N) приводят к значительному снижению активности лишь на одном из субстратов: в случае S13A это dGMP, а в случае D16N – dTMP. Замены W150F, K131E, T17S не приводят к значительному изменению активности ни на одном из субстратов.
Таким образом, падение ферментативной активности на различных акцепторах фосфорильной группы в результате мутагенеза происходит неодинаково. Следовательно, несмотря на наличие одного сайта связывания субстрата, тип азотистого основания оказывает влияние на катализ.
Анализ последовательности белка позволил получить модель структуры активного центра молекулы. Установлено взаимное расположение P-петли АТФ-связывающего центра и альфа-спиральных участков активного центра молекулы.
Сравнение аминокислотных последовательностей известных бактериальных пуриннуклеозидфосфорилаз с полученной в настоящей работе пуриннуклеозидфосфорилазой G.stearothermophilus (PuNPII) выявило общую консервативную структуру в активном центре ферментов, за исключением Tyr192, Ser234, Met236 и Ala237. Возможно, указанные аминокислотные остатки играют важную роль в повышении стабильности изучаемого фермента по сравнению с аналогом из E.coli. Для сравнения ферментативных активностей природных и рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз были определены константа Михаелиса и константа равновесия в реакциях фосфоролиза нуклеозидов. Пуриннуклеозидфосфорилаза G.stearothermophilus имеет Km для инозина 90мкМ, что близко к значениям ферментов-аналогов из E.coli, но имеет более высокую аффинность к гуанозину – 70 мкМ. Константы равновесия, определенные у изучаемых ферментов, полностью коррелируют с данными природных аналогов у родственных штаммов.
Предполагаемая высокая температурная стабильность рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus, подтвердилась при проведении очистки ферментного препарата пиримидиннуклеозидфосфорилазы (PyNP) от белков штамма-хозяина путем прогревания клеточных лизатов в течение 30 мин при 70oС и последующего осаждения термолабильных белковых агрегатов высокоскоростным центрифугированием. Полученный препарат имел чистоту около 80-85% по целевому белку и не содержал интерферирующих активностей. Производительность полученного штамма-продуцента PyNP составляла 283±22 мг белка ферментного препарата из 1 литра культуры. Производительность полученного штамма-продуцента PuNPII составляла 364±43 мг белка ферментного препарата из 1 литра культуры.
В ходе работы были получены данные о стабильности иммобилизованных ферментных препаратов (ИФП) нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus в широком диапазоне значений pH и температуры. Оптимум рН для ИФП в реакции трансгликозилирования в целом совпадал с оптимумом растворимых нуклеозидфосфорилаз (pH 7.5-8.0), но область значений, при которой фермент сохранял полную стабильность, была шире (рН 6.5-11.5). Оптимум температуры при синтезе dAdo варьировал от 80 oС (при соотношении по активности PuNPII к PyNP 2:1) до 86 oС (при соотношении по активности PuNPII к PyNP 1:2), что на 5-10 oС выше температурного оптимума для растворимых препаратов нуклеозидфосфорилаз G.stearothermophilus.
Из полученных в исследовании данных следует, что трансгликозилазная активность ферментного препарата при 20-кратном использовании снижалась приблизительно на 0.6-0.7% за цикл при 70 oС, что представляется достаточно хорошим показателем и обеспечивает технологическую перспективу для полученных ИФП. Кроме того, благодаря высокой удельной активности ИФП удалось достигнуть более 80% глубины превращения за 4-10 ч при содержании биокатализатора в реакционной смеси всего 1-5% (по объему). Это позволило эффективно использовать полученные ИФП для проведения реакций трансгликозилирования с широким спектром субстратов, в том числе, плохо растворимых, таких как гуанин, а также для синтеза фармацевтически значимых препаратов: 2-хлор-2’-дезоксиаденозин (2CldAdo), 9-β-D-арабинофуранозил-2-фтораденин (2FaraА), 1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (Рибавирин) и ряда природных нуклеозидов
Молекулярная генетика, механизмы реализации генетической информации, биоинженерия (47)
Исследование особенностей генетической вариабельности при аутоиммунных и онкологических заболеваниях человека
Лаборатория сравнительной и функциональной геномики
Проведен функциональный анализ обширной группы AluY ретроэлементов в интронах генов, продукты которых регулируют процессы дифференцировки и, предположительно, малигнизации лимфобластов.
По результатам генотипирования выборок здоровых доноров и больных с острым лимфобластоидным лейкозом (ОЛЛ) определены частоты встречаемости Alu-содержащих аллелей свыше 90 генов и отобрано 28 кандидатных локусов генома, для которых установлено статистически достоверное изменение частот встречаемости Alu-содержащего аллеля в выборке больных ОЛЛ. Так, для генов PTPLB, PTPN22, PTPRA и ERBB4, кодирующих тирозиновые протеинкиназы или их рецепторы, выявлено выраженное повышение частоты встречаемости Alu-содержащих аллелей в выборке больных. Превышение частот варьирует от 0,08 до 0, 23, а соответствующие факторы риска (OR) могут достигать 2,97. Выявлено резкое снижение (в 8-64 раза) транскрипции Alu-содержащих аллелей 18 генов в лимфоидных клетках больных ОЛЛ и здоровых доноров. Для 12 Alu-содержащих аллелей обнаружено полное ингибирование транскрипции в В-лимфобластах из крови и пунктатов костного мозга больных ОЛЛ. На основе Alu-содержащих аллелей, проявляющих наиболее выраженную активность в Т- и В-бластоидных клетках больных с острым лимфобластоидным лейкозом, нами создан уникальный набор функциональных молекулярно-генетических маркеров, который может найти применение как при проведении дальнейших исследований процессов дифференцировки и малигнизации лимфобластов, так и в медицинской практике для прогнозирования риска возникновения и развития онкологических заболеваний крови.
Разработан и успешно применен новый экспериментальный подход к определению полного индивидуального репертуара Т-клеточных рецепторов периферических лимфоцитов и выявлению клональной экспансии при аутоиммунных заболеваниях.
Подход объединяет а) оригинальный метод получения исчерпывающих селективных библиотек зрелых генов бета-цепей Т-клеточного рецептора (TCR-B) периферических лимфоцитов, б) оптимизированное использование современных платформ крупномасштабного секвенирования кДНК (NGS Next Generation Sequencing) и в) биоинформатический анализ данных NGS для реконструкции репертуара Т-клонотипов по структуре антиген-распознающих участков (CDR3) зрелых Т-клеточных рецепторов. Применение разработанного подхода для долговременного мониторинга репертуара Т-клеток у больных анкилозирующим спондилитом (АС) позволило выявить и охарактеризовать клональные экспансии и общую динамику репертуара при аутологичной трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (HSCT) и других видах терапии.
Создана серия экспрессионных конструкций, содержащих протективный и рисковый гаплотипы гена ERAP1
Полифункциональная аминопептидаза ERAP1 относится к числу ключевых ферментов, определяющих чувствительность лимфоцитов к ряду цитокинов и других факторов клеточной дифференцировки. Ранее нами по результатам анализа встречаемости 5 несинонимичных SNP нами были определены предположительно протективный и рисковый гаплотипы этого гена. За отчетный период создана серия экспрессионных конструктов, содержащих четыре аллельных варианта ERAP1(оба гаплотипа и их инвертированные мутанты) и получена панель лимфоцитарных (Jurkat, HL60, HT1080) клеточных сублиний, транзиентно экспрессирующих исследуемый трансген. Предварительный иммунохимический анализ полученных трансфектантов и культуральных сред выявил выраженные отличия в накоплении растворимой формы рецептора TNF – продукта одной из функциональных активностей аминопептидазы.
Структурный, функциональный и эволюционный анализ геномов и его применение в биотехнологии
Лаборатория структуры и функции генов человека
Исследование эволюционно-консервативной эпигенетической регуляции процессов раннего развития и герминогенного опухолеобразования - путь к терапии герминогенного рака.
Были продолжены комплексные исследования функций белков семейства PIWIL при развитии герминогенных опухолей человека. Разработана система для сравнительного определения уровня метилирования регуляторной области L1. Для 8 образцов ткани герминогенных опухолей и прилегающих к ним нормальных тканей яичка показано деметилирование 5’НТО (нетранслируемой области) L1 ретропозонов в герминогенных опухолях, при этом преимущественному деметилированию подвергаются человек-специфические ретропозоны (семейство L1HS). Поскольку снижение уровня метилирования может приводить к повышению уровня транскрипции транспозонов, проведено исследование уровня мРНК L1 в герминогенных опухолях. Показано, что количество транскриптов достоверно повышается в 6 (из 8) образцах опухоли по сравнению с соответствующими нормальными тканями. Таким образом показана корреляция деметилирования 5’НТО транспозонов L1 с повышением их транскрипции при образовании опухоли яичка. Для последующего изучения структуры внутриклеточных популяций коротких РНК, ассоциированных с каждым членом семейства белков PIWIL созданы генетические конструкции, содержащие кДНК piwil1-4 Получены 4 клеточные линии, стабильно экспрессирующие соответствующие белки. Синтез белков подтвержден вестерн-блот анализом с использованием антител на соответствующий PIWIL. Найдена новая изоформа белка PIWIL2, характерная только для тканей яичка и герминогенных опухолей. Определена нуклеотидная последовательность мРНК, соответствующей этой изоформе.
Сравнительный анализ транскриптомов патогенных микобактерий M. Tuberculosis при развитии инфекционного процесса in vivo.
Разработан метод инфицирования мышей M. tuberculosis штамм H37Rv внутрибрюшинно, для получения фагоцитов, инфицированных M. tuberculosis. Приток нейтрофилов через 16 часов и макрофагов через 120 часов симулировали введением пептона мышам линии В6. При недостаточно чистом обогащении макрофагами (примесь нейтрофилов из-за немедленной реакции на введение микобактерий) использовали предварительное удаление нейтрофилов in vivo c антителами анти-Ly6G.
Разработан метод выделения РНК из фагоцитов, обогащенной РНК M. tuberculosis, включающий в себя дифференциальный лизис инфицированных фагоцитов, выделение тотальной РНК и деплецию рибосомальных РНК.
Разработанными методами получены образцы РНК, выделенные из нейтрофилов и макрофагов (мыши линии В6), инфицированных M. tuberculosis. Проведен синтез кДНК PowerScript (Clontech), обогащение образцов микобактериальной кДНК подтверждено секвенированием отдельных клонов.
Проведение негативно-позитивной селекции инсуляторов в ретровирусной системе. Получение библиотеки
Полученными на предыдущем этапе ретровирусными частицами были инфицированы клетки-мишени линии CHO. Клетки, в геном которых интегрирован вектор, отбирались по их устойчивости к неомицину (G-418). Неомицин-устойчивые клетки были подвергнуты селекции в присутствии ганцикловира (негативная селекция). В этих условиях выживают только те клетки, которые перед минимальным промотором содержат вставки из фрагментов библиотеки, обладающие энхансер-блокирующей активностью. Таким образом, если в векторе между энхансером и промотором CMV будет расположена последовательность, обладающая активностью, снижающей экспрессию тимидинкиназы, то популяция дочерних клеток трансфицированной таким вектором клетки выживет. Подобную устойчивость к ганцикловиру могут придавать клеткам последовательности двух типов – инсуляторы и сайленсеры. Однако активность сайленсера может распространяться также и на промотор гена неомицинфосфотрансферазы, и клетки, несущие такой вектор погибают на стадии позитивной селекции, поскольку сайленсер определяется как элемент генома, способный подавлять активность промотора независимо от его положения и ориентации относительно природного или гетерологичного промотора. Таким образом, в результате позитивно-негативной селекции отбираются лишь энхансер-блокирующие последовательности.
На матрице выделенной из этих клеток геномной ДНК при помощи ПЦР со специфичных к концам клонов праймеров был амплифицирован пул потенциальных энхансер-блокирующих последовательностей, затем клонированый в плазмидный вектор. В результате описанных выше экспериментов была получена библиотека потенциальных инсуляторов
Секвенирование библиотеки, анализ последовательностей, построение и анализ физической карты расположения инсуляторов.
Полученная на предыдущем этапе работы библиотека потенциальных инсуляторов была секвенирована по технологии 454 (Roche). Всего было получено 220 последовательностей, картирующихся в исследуемой области генома. Сравнение этих последовательностей между собой выявило 17 независимых элементов, положения которых были нанесены на физическую карту локуса.
Молекулярно-функциональный анализ процессов клеточной трансдифференцировки в ходе формирования клеточного микроокружения в опухолях легкого и поджелудочной железы человека
Проведен анализ экспрессии генов регуляторов процесса эпителио-мезенхимального перехода в клетках и тканях опухолей поджелудочной железы и легкого. В ходе выполнения работы была показана повышенная активность генов ZEB2 и SNAIL (транскрипционных регуляторов процесса эпителио-мезенхимального перехода) в клетках стромального микроокружения рака поджелудочной железы.
Изучено влияние ростовых факторов опухолевого микроокружения на активность промоторов генов регуляторов процесса эпителио-мезенхимального перехода. Показано что ростовой фактор опухолевого микроокружения TGF-beta усиливает активность промоторов генов регуляторов процесса эпителио-мезенхимального перехода (ZEB2 и SNAIL) в опухолевых клетках рака поджелудочной железы и легкого, а также повышает активность анти-апоптотического гена сурвивина (BIRC5).
Разработка эффективных промоторных модулей для универсального использования в генно-терапевтических противоопухолевых средствах
1) Получены двойные тандемные промоторы на основе широко используемых опухолеспецифичных промоторов генов обратной транскриптазы теломеразы (phTERT) и сурвивина человека (phSurv). Показано на панели клеточных линий различного происхождения, что сконструированные двойные промоторы phTERT-hSurv, phSurv-hTERT функционально не являются механической суммой двух составляющих промоторов, а образуют новый функциональный многопрофильный промотор, отличающийся от всех известных промоторов, как по точке начала транскрипции, так и по повышенной активности в широком спектре опухолей.
2) Получены искусственные варианты промотора гена сурвивина человека с мутированным сайтом связывания белка p53. На панели клеточных линий человека и мыши различного происхождения показано, что активность ряда полученных мутантных вариантов промотора гена сурвивина человека превосходит активность нативного промотора гена сурвивина в несколько раз.
3) Сконструирована система усиления опухолеспецифической экспрессии гибридного гена-убийцы цитозиндезаминазы-урацилфосфорибозилтрансферазы (FCU1), в которой используется сочетание двух экспрессирующих конструкций: гена рекомбиназы Cre под контролем модифицированного промотора гена сурвивина человека (phSurv4) и гена FCU1, отделенного от конститутивного промотора цитомегаловируса терминатором транскрипции вируса SV40, который содержит по краям сайты узнавания рекомбиназы Cre (loxP-сайты). Показано, что одновременное введение этих двух конструкций в клеточные линии с фенотипом р53(-) приводит в присутствии 5-фторцитозина к увеличению цитотоксического эффекта в 4-5 раз по сравнению с прямой регуляцией экспрессии FCU1 промотором pSurv4. Это происходит за счет Cre-зависимого удаления терминатора, приводящего к экспрессии гена FCU1 под контролем сильного промотора pCMV. Использование системы Cre-LoxP не приводит к усилению экспрессии гена FCU1 в клетках с фенотипом р53(+).
Регуляция синтеза рибосомных белков
Лаборатория структуры и функции генов человека
- Исследование транскрипционного контроля оперонов р-белков in vivo
Для генов рибосомных белков E. coli (rpsA, rpsB, rpsO, rpsT) показано, что их экспрессия регулируется не только на стадии инициации трансляции по механизму ауторепрессии, но и на стадии транскрипции. Промоторы этих генов (Р1 и Р3 rpsA, PrpsB, PrpsO, P1 rpsT) подвержены негативной регуляции низкомолекулярным алармоном ppGpp, который синтезируется в клетке в ответ на индуцируемое голодание по серину при обработке серингидроксаматом. Впервые показано, что природные ингибиторы аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз), антибиотики микроцин С и альбомицин, вызывают не только остановку синтеза белка и роста клеточных культур, но и ингибируют транскрипцию генов, кодирующих рРНК и р-белки, по механизму строгого ответа (stringent response) благодаря повышению уровня синтеза ppGpp RelA-синтазой в ответ на аминокислотное голодание. Также впервые показано, что RelA-зависимый синтез ppGpp жизненно необходим для выживания клеток E. coli в условиях остановки роста под действием антибиотиков-ингибиторов АРСаз: в ppGpp+-штаммах микроцин С и альбомицин проявляют только бактериостатические свойства (выживаемость близка к 100%), а в ppGpp0-мутантах оказывают сильный бактерицидный эффект (выживаемость падает на 4-5 порядков). Предположительно, в отсутствие ppGpp невозможно переключение транскрипции на промоторы, узнаваемые альтернативными сигма-факторами и отвечающими за синтез антистрессовых белков.
2. Изучение роли транскрипционного фактора DksA в регуляции транскрипции оперонов р-белков
Белок DksA является кофактором алармона ppGpp, и при делеции гена dksA ppGpp не способен эффективно ингибировать транскрипцию с промоторов оперонов рибосомных РНК. Исследование влияния DksA на транскрипцию генов рибосомных белков методом ОТ-ПЦР показало, что их промоторы реагируют на делецию dksA-гена сходным образом: при отсутствии DksA в клетке многие промоторы генов р-белков не снижают эффективности при повышении уровня ppGpp при аминокислотном голодании (имеются исключения). Интересно, что хотя транскрипционные профили рибосомных генов в ppGpp0- и dksA-мутантах в целом похожи, мутанты, не способные к синтезу ppGpp, под действием микроцина С или альбомицина погибают, а dksA-мутант сохраняет 100% выживаемости. Это позволяет сделать вывод, что в отличие от ppGpp для включения антистрессовых механизмов фактор DksA не требуется.
Структурная и функциональная геномика вирусов бактерий
Лаборатория молекулярной биоинженерии
Выделено два бактериофага Pseudomonas, отличающиеся необычными условиями существования (горячие источники), вероятно представляющие собой новые таксономические виды вирусов.
Получены кристаллы протеазоустойчивого фрагмента белков хвостового чехла (gp29) и базального стержня (gp131) бактериофага phiKZ, получен набор дифракционных данных, определены структуры белков.
Определены квазиатомные структуры белков хвостовых шипов и аппарата инъекции ДНК ряда бактериофагов (gp43 фага SN, gp164 фага phiKZ, gp27 фага 297, gp76 фага AP22, получен ряд делеционных мутантов с целью выяснения закономерностей строения и функций.
В сотрудничестве с институтом кристаллографии РАН метод малоуглового рассеяния применен для определения структуры фибриллярного белка gp37 фага Т4 и шаперонина фага ЕL.
Разработана и опробована генетически обоснованная система ПЦР-типирования терапевтических бактериофагов Pseudomonas и Staphylococcus для подбора лекарственных смесей, промышленно выпускаемых НПО «Микроген»
Определены условия кристаллизации 4 белков, предназанченных для кристаллизации в условиях микрогравитации во время экспедиций МКС 23 - 29.
Исследование механизмов активации клеточной пролиферации при развитии злокачественных опухолей мочеполовой системы
Группа геномного анализа сигнальных систем клетки
По распространенности среди опухолей мочевыделительной системы рак мочевого пузыря (РМП) занимает 2-е место, а среди всех злокачественных новообразований — 9-е место в мире. Нами для одних и тех же образцов тканей впервые было проведено системное исследование таких молекулярно-генетических аспектов развития РМП, как: изменения транскриптома, изменения метилирования геномной ДНК, изменения в представленности коротких РНК, наличие протяженных геномных делеций и дупликаций. Исследование было проведено для выборки из 18 раковых и 30 нормальных тканей. Использовались методы секвенирования нового поколения на платформе Illumina, супрессионной вычитающей гибридизации кДНК, микрочиповой гибридизации кДНК и геномной ДНК, ПЦР в реальном времени, биоинформатической обработки больших массивов данных. Были обнаружены шесть новых молекулярных маркеров развития РМП. Кроме того, в рамках настоящего проекта мы создали пакет программного обеспечения, осуществляющий автоматическую обработку данных микрочиповой гибридизации для анализа активированных или подавленных путей внутриклеточной сигнализации.
Характеристика транскрипционно-регуляторной активности мобильных элементов генома человека, располагающихся вблизи точек начала транскрипции известных генов
Группа геномного анализа сигнальных систем клетки
Обнаружено единственное специфичное для ДНК человека семейство мобильных элементов, названное CpG-SVA. Представители семейства содержат на 5'- конце CpG-островок гена MAST2, а на 3'- конце – фрагмент ретротранспозона SVA. Мы показали, что последовательность CpG-островка играет ключевую роль в транскрипционной регуляции и обеспечивает активацию в сперматогониальных клетках, способствуя быстрому накоплению геномных копий CpG-SVA. Обнаруженное нами семейство, названное CpG-SVA, сформировалось уже после разделения предковых линий человека и шимпанзе и присутствует только в человеческом геноме, будучи представленным по крайней мере 76 копиями. Мы показали, что последовательность CpG-островка имеет важнейшую роль в регуляции транскрипции представителей CpG-SVA и обеспечивает транскрипционную активацию в созревающих сперматогониальных клетках. Мы показали высокий уровень корреляции между уровнями экспрессии CpG-SVA, гена MAST2 и других активных мобильных элементов человека. Важно, что наблюдалась также положительная корреляция с экспрессией белков ретротранспозона L1, обеспечивающих размножение CpG-SVA в геноме. Таким образом, разгадана загадка аномальной «успешности» CpG-SVA: ведь единственный предковый элемент CpG-SVA в геноме человека (то есть <0,1% от всех копий SVA) дал ~9% от всех зафиксированных в геноме человек-специфичных вставок SVA. Кроме того, показана корреляция уровней транскрипции гена MAST2 и активных мобильных элементов не только у человека, но и у других млекопитающих. Предложена гипотеза, что у млекопитающих активация MAST2 на определенных стадиях сперматогенеза происходит под действием специфического набора транскрипционных факторов, одновременно с волной массированного деметилирования ДНК, высвобождающей экспрессию мобильных элементов.
Исследование мутагенеза у эукариот
Лаборатория биотехнологии
В 2011 г. при выполнении этапа «Разработка метода снижения фона из-за неспецифических разрывов ДНК» была решена проблема фона, возникающего за счет внесения в ДНК анализируемой последовательности неспецифических разрывов при ее обработке. Начат переход на анализ продуктов рестрикции методом цифровой ПЦР. Для этого совместно с С-Петербургским Институтом аналитического приборостроения усовершенствован и испытан прибор для счета отдельных молекул ДНК методом твердофазной ПЦР.
При выполнении этапа «Поиск новых мутаций путем секвенирования всего гена CYP21» был секвенирован полноразмерный ген у 16 пациентов с признаками гиперандрогении. Установлено, что ген обладает уникальным полиморфизмом: набор однонуклеотидных замен в гене не повторялся ни у одного пациента. При этом была обнаружена новая синонимическая однонуклеотидная замена в экзоне 8. Полиморфизмы кластеризованы в гене и располагаются по границам некоторых экзонов, а также в окрестностях инициирующего и терминирующего кодонов гена. На основании полученных данных высказывается предположение о новом генетически детерминированном механизме возникновения патологического фенотипа у обследованных пациентов. В соответствии с гипотезой, считавшиеся ранее нейтральными однонуклеотидные замены на самом деле могут изменять пространственную структуру предшественника мРНК или самой мРНК и нарушать ее нормальный процессинг или трансляцию, понижая экспрессию гена. Гипотеза будет проверена в 2012 г. путем секвенирования дополнительных генов, а также определения гаплотипов уже секвенированных генов и построения моделей пространственной структуры участков последовательностей, содержащих SNP.
При выполнении этапа «Разработка метода анализа метилирования промотора с использованием цифровой ПЦР» предложен новый метод выявления метилированных участков ДНК, основанный на появлении или исчезновении сайтов рестрикции в ДНК, подвергнутой бисульфитной модификации.
Ишемический инсульт в молодом возрасте
Лаборатория биотехнологии
В 2011 г. при выполнении этапа «Выявление 12 мутаций в генах системы гемостаза у больных с инсультом» темы «Ишемический инсульт в молодом возрасте» для уточнения диагноза были дополнительно исследованы 12 генов системы гемостаза и метаболизма варфарина у 20 пациентов. Исследование на этом было завершено. В настоящее время проводится обработка всех полученных результатов.
Выявление и изучение новых компонентов протеома человека, участвующих в формировании и экспорте мРНК из ядра
Лаборатория механизмов генной экспрессии
C помощью генетического (дрожжевая двухгибридная система) и биохимического (соосаждение белков из клеточных лизатов) подходов показаны взаимодействия специфических субъединиц РНК-полимеразы II человека hRPB11b и hRPB11с сразу с четырьмя различными компонентами фактора инициации трансляции EIF3 Homo sapiens (eIF3a, eIF3i и двумя вариантами eIF3m), в том числе с впервые обнаруженной изоформой eIF3m = ncEIF3m (242 а.о.), имеющей предпочтительно ядерную локализацию. В протеоме человека впервые найдены белки-партнёры этого нового белка Homo sapiens: установлено, что eIF3m, помимо трёх разных изоформ субъединицы hRPB11 (hRPB11a, hRPB11b и hRPB11с), взаимодействует также с субъединицей фактора инициации трансляции человека eIF3a, а также с белком p15 (NXT1, MTR2), участвующим в транспорте мРНК из ядра в цитоплазму.
Структурно-функциональный анализ энзиматического метилирования ДНК эукариот в эпигенетических процессах
Лаборатория биотехнологии растений
При сотрудничестве со специалистами из Белорусского Республиканского научно-практического центра гематологии и трансфузиологии (г. Минск) был проведен анализ сайт-специфического метилирования в образцах ДНК, выделенной из нормальных и патологических ядросодержащих клеток крови и костного мозга пациентов с различными формами лейкозов и находящихся на разных стадиях течения и терапии заболевания. Выявлены особенности сайт-специфического метилирования регуляторно-промоторной области гена MDR1, характерные для различных стадий развития и протекания гематологических неоплазий, что создает предпосылки подходов к разработке высокочувствительного метода молекулярной диагностики лейкозов и, по-видимому, позволит включить данные по анализу метилирования промотора данного гена в список молекулярных онкомаркеров. Анализ регуляторно-промоторной области гена MDR1 показал присутствие специфических повторяющихся последовательностей (ALU-повторы), которые могут оказывать существенное влияние на локальную конформацию хроматина в зависимости от степени метилирования.
С учетом сайтовой специфичности и размеров DNMT1, cинтезированы модифицированные олигодезоксинуклеотиды, проявляющие по отношению к ней ингибирующее действие. Проведена сборка и очистка олигодезоксинуклеотид-белковых комплексов, состоящих из модифицированного белка M.HhaI-GFP, и продемонстрировано их ингибирующее действие на коммерческие препараты человеческой ДНК-метилтрансферазы DNMT1.
Сконструирован специализированный вектор, содержащий модифицированный сигналом ядерной локализации ген CpG-специфичной бактериальной ДНК-метилтрансферазы HhaI под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. С применением разработанного в лаборатории метода трансформации, полученной конструкцией проведена трансформация растений Mesembryanthemum crystallinum. Проведен анализ морфолого-биохимических а также молекулярно-биологических особенностей характерных для растений Mesembryanthemum crystallinum трансформированных геном M.HhaI в нормальных условиях и в условиях засоления (0,5 M NaCl) и засухи по сравнению с нормальными контрольными растениями.
Исследовано взаимодействие растений Mesembryanthemum crystallinum с бактериями
Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas putida, Methylovorus mays. Обнаружены изменения
уровня метилирования генома колонизированных растений.
Реконструкция in vitro мультиферментного комплекса биосинтеза экзополисахаридов у симбиотических бактерий Rhizobium leguminosarum
Группа молекулярной экологии
Показано, что ко-трансляция мРНК гликозилтрансфераз PssE, PssD и PssА в присутствии липосом, полученных из фосфолипидов клеток Rhizobium leguminosarum, приводит к образованию протеолипосом. При этом интеграция белков PssE и PssD в липосомы происходит только при совместной трансляции cоответствующих мРНК.Эффективность связывания белков PssE, PssD и PssА с липосомами возрастает при трансляции мРНК всех трех гликозилтрансфераз.
Установлено, что гликозилтрансферазы в составе протеолипосом функционально активны. Ферментативную активность белков анализировали при инкубировании протеолипосом с предшественниками синтеза ЭПС (UDP-[14С]-Glc, UDP-Gal, UDP-GlcA).
В результате показано, что PssA является UDP-глюкоза:полипренилфосфат-глюкозофосфотрансферазой, а PssD и PssE – субъединицами UDP-глюкуронозил-
(-4)-глюкозилтрансферазы.
Молекулярные механизмы клеточной дифференцировки, иммунитета и онкогенеза (48)
Исследование молекулярных механизмов аутоиммунных заболеваний на примере болезни Бехтерева
Группа Флуоресцентных инструментов
Новые алгоритмы анализа и новая версия программного обеспечения для системного анализа массивов данных репертуаров Т клеточных рецепторов.
Разработана новая версия программного обеспечения для системного анализа массивов данных индивидуальных репертуаров Т клеточных рецепторов человека, которая, в отличие от предыдущей версии, позволяет проводить анализ альфа цепей Т клеточных рецепторов, и использует более эффективный алгоритм коррекции типичных ошибок платформ секвенирования нового поколения 454, Illumina и IonTorrent, в том числе с ассиметричной коррекцией исходных данных флуорограмм. Введены новые возможности для системного анализа, кросс-сравнения и экспорта массивов данных Т клеточных рецепторов и продуктов их анализа. Частично опубликовано в EMBO Mol Med. 2011, основные результаты в процессе публикации. Отработана технология мультиплекс амплификации вариабельных фрагментов Т-клеточных рецепторов с малых количеств ДНК из FACS-сортированных популяций фиксированных Т лимфоцитов. Технология необходима для последующего масс-сиквенс анализа специфических субпопуляций Т-лимфоцитов, требующих предварительной фиксации перед сортировкой. В частности, непосредственный интерес для нашей работы представляют субпопуляции Th17 лимфоцитов и регуляторных FoxP3-позитивных Т-лимфоцитов.
Тетрамеры MHC HLA-B27 с УФ-выщепляемыми замещаемыми лигандами.
В совместной работе с проф. Шумахером (Амстердам), получены тетрамеры HLA-B27 с УФ-выщепляемыми замещаемыми лигандами (conditional ligands). На их основе получен ряд тетрамеров HLA-B27, несущих различные вирусные пептиды. Показана их высокая эффективность для окрашивания специфичных субпопуляций Т лифмоцитов.
Технология амплификации библиотек вариабельных фрагментов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов.
На примере образов крови 4 больных аутоиммунным заболеванием, отработана технология равномерной амплификации и массированного секвенирования вариабельных фрагментов тяжелых и легких цепей антител человека. Ведется разработка программного обеспечения для эффективного анализа данных.
Красные и дальнекрасные флуоресцентные белки
Разработанный в ходе предыдущей работы белок eqFP650 с высокой яркостью в инфракрасном диапазоне, опубликованный группой в 2010 году, был использован в совместной работе с группой проф. Luker в США для визуализации опухолевых клеток в модельных мышах при исследованиях закономерностей взаимодействия различных подтипов опухолевых клеток в ходе метастазирования.
Получен низкотоксичный супермономерный красный флуоресцентный белок, оптимальный для мечения белков слияния. На его основе получены дальнекрасный и фотоактивируемые супермономерные версии.
Изучение биологической активности и механизма действия миелопептидов. Разработка новых лекарственных средств на основе миелопептидов
Лаборатория клеточных взаимодействий
Анализ дифференцировочных эффектов МП-4 и МП-6 в модели оценки стимуляции эритропоэза клеток линии К-562 по выработке ими гемоглобина (бензидиновый тест).
Создание препаратов, способных восстанавливать процесс дифференцировки трансформированных клеток-предшественников, является одним из новых разрабатываемых подходов к лечению лейкозов. Ранее нами было продемонстрировано, что миелопептиды МП-4 и МП-6 обладают дифференцировочной активностью в культуре опухолевых клеток костномозгового происхождения. Основываясь на этих данных, мы протестировали способность МП-4 и МП-6 к индукции созревания эритромиелолейкозной линии К562 до зрелых, функционально активных клеточных форм – продуцентов гемоглобина. С применением бензидинового метода детекции гемоглобина было установлено, что под действием миелопептидов МП-4 и МП-6 уровень синтеза гемоглобина в культуре клеток К562 достигает и даже значительно превосходит таковой, достигаемый при использовании ДМСО – стандартного индуктора дифференцировки клеток К562 в эритроидном направлении. Полученные результаты указывают на возможность использования МП-4 и МП-6 для создания новых противолейкозных препаратов.
Новые подходы к коррекции иммунного ответа: исследование иммуномодулирующих эффектов белков теплового шока, ганглиозидов и пептидов – аналогов иммунодоминантных эпитопов антигенов
Лаборатория клеточных взаимодействий
Сравнительный анализ иммуномодулирующих эффектов взаимодействия с NK-клетками БТШ70 и стресс-индуцируемых протеинов семейства MICA.
В работах многих авторов и в наших исследованиях было продемонстрировано, что присутствие стресс-индуцируемых протеинов, в частности БТШ70 и MICA, на поверхности опухолевых клеток приводит к активации цитотоксических эффекторов иммунной системы, в том числе NK-клеток. В то же время внеклеточные формы этих протеинов оказывают прямо противоположное действие на цитотолитическую активность клеток-киллеров. Для анализа причин указанных различий нами были проведены исследования влияния экзогенного пула БТШ70 на экспрессию MICA опухолевыми клетками. Было обнаружено, что внеклеточные БТШ70 оказывают ингибирующее действие на уровень экспрессии поверхностных MICA. Причем данный ингибирующий эффект регистрировался как в нормальных условиях культивирования клеток, так и в условиях клеточного стресса. Мы рассматриваем полученные результаты как одно из проявлений хорошо известных протективных свойств экзогенных БТШ70 и как свидетельство двойственной роли пула этих протеинов во взаимодействии NK-клеток с опухолевыми клетками-мишенями.
Разработка гетерологичных пептидных вакцин против аллергии, вызванной грибами Aspergillus, Penicillum и клещами домашней пыли.
При разработке противоаллергенных вакцин использован особый прием, позволяющий вызывать иммунный ответ на основные белки аллергена при минимальной затрате ресурсов организма. Прием основан на использовании предсуществующих Т-клеток памяти, специфичных к другим антигенам (белкам вируса гриппа). Для мобилизации имеющегося у большинства населения пула Т-клеток памяти получены специально устроенные коньюгаты пептидов, включающие отобранные пептиды капсидных белков вируса гриппа штамма N1H1. Указанная популяция регуляторных Т-клеток активирует протективный В-клеточный ответ, специфичный к содержащимся в вакцине пептидам – аналогам В-эпитопов основных белков аллергенов. Разработанная вакцина представляет собой суспензию наночастиц из модифицированного хитозана, внутри которых размещены гидрофобные пептиды-Т-эпитопы белков вируса гриппа, а на внешней поверхности наночастиц экспонируются гидрофильные пептиды аллергена.
Разработка системы доставки противоопухолевых препаратов (доксорубицина) на основе модифицированного хитозана.
Хитозан используется не только носителем для разрабатываемой нами противоаллергенной вакцины, но также и для доставки противоопухолевых препаратов. Нами совместно с лабораторией полимеров для биологии разработан метод получения наночастиц из гидрофобного модифицированного хитозана. Также отработан метод химической коньюгации доксорубицина с хитозаном и формирование частиц их коньюгированного хитозана. Полученные частицы имеют размер около 150 нм. Нами проведены исследования сравнительной активности доксорубицина и доксорубицина в составе наночастиц в мышиной модели рака молочных желез WNT1. Показали, что активность доксорубицина не отличается, но токсичность снижается при доставке лекарства с помощью наночастиц хитозана.
Новые подходы к коррекции иммунного ответа: исследование иммуномодулирующих эффектов белков теплового шока, ганглиозидов и пептидов – аналогов иммунодоминантных эпитопов антигенов
Группа липидных модулятороыв иммунитета
- Для характеристики влияния ганглиозида GM1 на уровень упорядоченности липидов мембраны исследовано фазовое состояние модельных многокомпонентных рафтообразующих мембран путем регистрации и анализа температурной зависимости анизотропии флуоресценции метки, связанной со сфингомиелином. Данная метка распределяется преимущественно в жидко-упорядоченную (рафтовую) фазу. Измерения проведены при концентрации ганглиозида GM1 в мембранах в диапазоне 0-7 моль%. Для анализа результатов проведено приближение дискретной экспериментально определяемой зависимости r'(T1) двумя линейными функциями. Показано, что при низкой концентрации ганглиозида (0–2 моль%) в системе происходит фазовый переход при температуре Th 33–35°С. При увеличении концентрации GM1 (3–7 моль%) появляется новый фазовый переход при температуре Tl 21–25°С, связанный, по-видимому, с формированием доменов, обогащенных ганглиозидом и сфингомиелином. Одновременно пропадает фазовый переход при температуре Th, что объясняется отпочкованием рафтовых областей от исходной мембраны при высоком содержании GM1.
2. Ганглиозид GD2 – антиген, ассоциированный с нейробластомой и меланомой. Он также экспрессирован, в разной степени, на поверхности клеток рака кости, саркомы мягких тканей, мелкоклеточного рака легких. Моноклональные антитела (мАТ) к ганглиозиду GD2 способны индуцировать апоптоз клеток этих опухолей. Применение антител существенно ограничивают их низкая способность проникать внутрь плотных сòлидных опухолей, а также проходить через гемато-энцефалический барьер, поэтому были получены и охарактеризованы специфические к ганглиозиду GD2 Fab-фрагменты антител, лишенные этих недостатков. МАТ, специфические к ганглиозиду GD2, выделены из кондиционной среды гибридомы, их Fab-фрагменты получены протеолитическим расщеплением папаином Оценка специфичности Fab-фрагментов на клетках мышиной лимфомы EL-4 и методом дот-блота с ганглиозидом GD2 показала связывание фрагментов с антигеном с такой же эффективностью, как и для полноразмерной молекулы антитела. Показано, что Fab-фрагменты, также как и целые антитела, ингибируют пролиферацию клеток мышиной Т-лимфомы EL-4 дозо-зависимым способом и уже через 24 ч инкубации индуцируют их апоптоз.
Функции нового опухолевого супрессора PDLIM4 (RIL) в нормальных клетках и при опухолевой трансформации
Группа экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки
основной акцент в исследованиях был сделан на выявление корреляции между злокачественным фенотипом линий клеток рака молочной железы истатусом активации онкогена Src. Согласно выдвинутой нами гипотезе, опухоли молочной железы можно подразделить на две группы, в зависимости от механизма активации гена Src. В слабо-инвазивных раках мы ожидали эпигенетическую супрессию гена RIL, за счет которой происходит умеренная активация онкогена Src без его активирующей мутации. Напротив, в высокоинвазивных раках молочной железа мы ожидали проявление активирующих мутаций гена Src, причем уровень белка RIL может быть либо неизмененным, либо повышенным (как компенсация на повышенную активность Src). Эта гипотеза смогла бы объяснить противоречивые данные, полученные нами ранее, при которых выраженность трансформированного фенотипа была большой в случае нормальных или несколько повышенных уровнях экспрессии гена супрессора RIL. Для выяснения этого вопроса нами проведено измерение активности Src в панели линий клеток рака молочной железы. Активность измеряли в киназном тесте, с измерение фосфорилирования стандартного субстрата онкогена Src. Полученные данные указывают на то что, в линиях клеток, характеризующихся повышенной инвазивностью (MDA-MB231, -435S, -436 и BT-474) активность онкогена Src была более чем на порядок выше по сравнению с линиями с меньшей инвазивностью (MCF-7, BT-20, T-47D и MDA-MB-468). Для определения влияния экспрессии белка RIL на злокачественный фенотип в две линии клеток, характеризующихся противоположными свойствами (MDA-MB231 и MCF7) была введена лентивирусная конструкция экспрессирующая полноразмерный RIL, после чего определены параметры роста клеток, наряду с анализом строения цитоскелета. В высокоинвазивной линии клеток RIL не вызывал заметых изменений, в то время как в линии клеток MCF7 наблюдалось резкое замедление скорости роста, вплоть до полной остановки делений, сопутсвующее изменению актинового цитоскелета. Мы также провели иммунопреципитацию белка RIL и измерили активность онкогена Src в иммунопреципитатах. Активность детектировалась только в линии MCF7, и не детектировалась в MDA-MB231, несмотря на более высокий уровень активности белка Src в тотальном экспракте. Эти данные указывают на нарушение связывания киназы Src с белком RIL в клетках MDA-MB231.
Второе направление было связано с изучением роли короткой изоформы белка RIL в регуляции актинового цитоскелета. Было установлено, что эта изоформа имеет короткий период жизни, что объясняется альтернативной слабоструктурированной C-концевой частью. Короткая изоформа RIL быстро разрушается в 20S протеасомах. Мы установили также что короткая изоформа RIL связывается с полноразмерной изоформой и направляет ее в разрушение, в результат чего в клетках экспрессирующих повышенные уровни короткой изоформы наблюдается снижение уровня белка RIL. Эти изменения проходили параллельно с изменениями актинового цитоскелета, изменением формы клеток и их подвижности. Наконец, мы установили, что некоторые стрессовые воздействия, такие как окислительный стресс, вызывают стабилизацию короткой изоформы RIL, что приводит к заметному изменению подвижности клеток
Изучение роли GMDP-связывающего белка YB-1 в передаче сигнала мурамилпептидов.
Группа иммунохимии ФИБХ
В соответствии с запланированными на 2011 год исследованиями к белку YB-1 были получены моноклональные антитела. Для получения моноклональных антител мыши линии Balb/c были иммунизированы кроличьим YB-1, и полученные в результате гибридизации клоны-продуценты моноклональных антител размножены в составе асцитной жидкости. Всего было получено 5 клонов. Моноклональные антитела были охарактеризованы и проанализированы в иммуноблотинге. Все антител принадлежали к классу IgG и содержали легкую kappa-цепь. Проведено эпитопное картирование полученных антител. Антитела YB-1-1, YB-1-3, YB-1-5 узнавали последовательность QPPAAPA, соответствующую N-концевому участку YB-1. Антитела YB-1-4 узнавали последовательность APEGQAQQ, соответствующую участку 177-184 YB-1.
Для анализа физического взаимодействия белка YB-1 с белками семейства NLR предполагалось клонировать фрагменты последовательностей, кодирующих соответствующие белки, и экспрессировать белковые продукты для последующей иммунизации. С этой целью была амплифицирована последовательность кодирующая аминокислоты 1-220 белка NOD2, и соответствующий полипептид экспрессирован в клетках E. coli Rosetta. Продукт экспрессии был выделен с помощью металл-хелатной хромотографии.
Моноклональные антитела для диагностики энтеротоксинов стафилококков: получение и применение
Группа иммунохимии ФИБХ
В соответствии с запланированными на 2011 год исследованиями к энтеротоксину Н и токсину тканевого шока стафилококков были получены моноклональные антитела. Для получения моноклональных антител мыши линии Balb/c были иммунизированы соответствующими токсинами, полученные в результате гибридизации клоны-продуценты моноклональных антител размножены, а антитела наработаны в составе асцитной жидкости. Всего было получено 5 клонов для SEHи 18 моноклональных антител к TSST. Моноклональные антитела были охарактеризованы и проанализированы в ИФА и иммуноблотинге. Все антител принадлежали к классу IgG и содержали легкую kappa-цепь. Анатитела к давали одну пару к токсину, а антитела к TSST давали три независимых пары, анализ в тесте аддитивности показал наличие антител независимо реагирующих с токсином, предположительно имеющих дистанцировавнные эпитопы.
Биофизика, радиобиология, математические модели в биологии, биоинформатика (50)
Структура, динамика, механизмы действия и биологическая функция мембранных и мембрано-активных белков и пептидов
Лаборатория моделирования биомолекулярных систем
Исследование димеризации ТМ домена белка-предшественника бета-амилоида (ПБА).
Получен набор моделей пространственной структуры димеров ТМ фрагментов полноразмерного ПБА (ПБАтм), двух его мутантов (T714I, V717G), а также варианты, укороченные на 3 (первый сайт ферментативного расщепления) и на 6 остатков (второй сайт ферментативного расщепления). (2) Примембранный участок может модулировать димеризацию посредством образования водородных связей с ТМ участком. (3) Катион-связывающий домен может стабилизировать димер за счет контактов между катион-связывающими доменами. (4) Изучены эффекты, вызванные изменением границ ТМ спирали в белке дикого типа и его мутантных формах за счет погружения примембранного участка пептида в бислой. (5) Мутации не оказывают сильного влияния на структурно-динамические характеристики димеров, но затрагивают процессинг ПБА, изменения которого могут приводить к развитию заболевания. Так, мутации в примембранном участке вызывают заглубление ТМ-фрагмента ПБА в мембрану, что может способствовать появлению укороченных фрагментов ПБА и вызывать формирование амилоидных бляшек. Мутации в ТМ спирали могут оказывать влияние на эффективность переходов димер-мономер и, следовательно, тоже влиять на процессинг ПБА.
Конформационная динамика димеров ТМС рецептора типа 3 фактора роста фибробластов (FGFR3) и ее возможная роль в активации рецепторов.
Набор моделей пространственной структуры ТМ димеров FGFR3 получен с использованием вычислительного подхода, описанного выше, а также с помощью оригинального метода оценки свободной энергии димеризации. Сравнение полученных результатов с экспериментальными данными позволило предложить механизмы возможных конформационных перестроек, происходящих при активации рецептора. Показано, что: (1) Для ТМС FGFR3 дикого типа возможны два состояния димера с симметричной областью контакта. Структуры стабильны в липидных бислоях с разными физико-химическими свойствами – из ДМФХ и ПОФХ. Энергия димеризации для этих состояний различна и не зависит от бислоя. (2) Мутации не вызывают существенных структурных перестроек димеров и не влияют на эффективность взаимодействия ТМС в структуре с минимальной энергией (конформация S1), а эффективность димеризации второй структуры (S2) возрастает. (4) Предложена модель конформационных перестроек, происходящих при активации рецептора. В неактивном состоянии рецептор находится в состоянии S1, а при связывании лиганда переходит в состояние S2. Мутации вызывают смещение равновесия в сторону активной формы, что приводит к неконтролируемой передаче в клетку сигнала пролиферации и, в итоге, к развитию патологических процессов. Указанная модель позволяет объяснить большинство из известных экспериментальных данных по димеризации ТМС FGFR3.
Димеризация ТМС в семействе рецепторов 1-4 эпидермального фактора роста: Erbb1, Erbb2, Erbb3, Erbb4.
Для этого семейства рецепторных тирозинкиназ (РТК) изучен характер упаковки всех возможных гомо- и гетеродимеров. Установлено, что онкогенная активность пар ErbB1-ErbB2 и ErbB2-ErbB3 (а также ErbB2 с патогенной мутацией V659Q) коррелирует с высокой эффективностью упаковки ТМС в соответствующих гетеро- и гомодимерах. Изучено влияние липидного окружения (бислои ДМФХ, ПОФХ, сфингомиелин, ДЕФХ) на эффективность димеризации ТМС ряда белков (Bnip3, Epha2, Erbb1/Erbb2, PDGFR-β) с использованием расчетов МД в явно заданном окружении. Для димера PDGFR-β показано, что стабильность право- и левозакрученной конформаций зависит от липидного состава мембраны. Левозакрученная конформация димера наиболее стабильна в рафт-подобных липидных бислоях (например, содержащих сфингомиелин). Полученные результаты согласуются с данными спектроскопии ЯМР.
Построение модели пространственной организации тримера из ТМС гемагглютинина вируса гриппа.
Изучен характер формирования мембранных тримеров для фрагментов гемагглютининов H6 и H14, относящихся к разным функциональным группам белков данного семейства. Показано, что гомо-тример H14 имеет более плотную упаковку и стабильную структуру по сравнению с H6. Важную роль в формировании межспиральных контактов в тримере Н14 играют ароматические остатки. Полученные результаты хорошо согласуются с имеющимися биохимическими данными.
Структурно-динамические свойства смешанных липидных бислоев, имитирующих мембраны эукариот и бактерий.
Методом МД проведена серия длительных (80-100 нс) расчетов гидратированных 2-компонентных бислоев, состоящих из цвиттерионных (диолеоилфосфатидилхолин, ДОФХ) и анионных (диолеоилфосфатидисерин, ДОФС) липидов, имеющих одинаковые ненасыщенные ацильные цепи, но разные полярные головка. Всего исследовано 9 систем с разным содержанием ДОФХ/ДОФС. Цель: Изучение на молекулярном уровне структурно-динамические и др. физико-химические свойства смешанных бислоев, имитирующих мембраны бактерий; Анализ латеральных микро-гетерогенностей (до 10 нм), определяющих квазиравновесные характеристики и, следовательно, функциональные свойства 2-компонентных мембран. Результаты: 1) Показано, что рассчитанные значения геометрических и динамических параметров рассмотренных систем (площадь на молекулу липида, толщина бислоя, параметры порядка ацильных цепей липидов) хорошо согласуются с имеющимися экспериментальными данными, что подтверждает адекватность выбранного вычислительного подхода. 2) Геометрические параметры меняются линейно в зависимости от концентрации одного из липидных компонентов. 3) При 20-30% содержании ДОФС липидный бислой имеет ряд важных особенностей – необычные (по сравнению с другими ДОФХ/ДОФС системами) параметры взаимодействия молекул липидов с катионами и молекулами воды, характеристики латеральной кластеризации липидов, наличие аномального пика плотности ацильных цепей в середине бислоя и др.). Интересно, что в составе клеточных мембран содержание анионных липидов также составляет 20-30%. 4) При увеличении концентрации ДОФС площадь гидрофильной части поверхности бислоя увеличивается за счет уменьшения нейтральной. При этом доля площади гидрофобной поверхности бислоя не меняется. Сделаны выводы о роли анионных липидов в структурно-динамической и гидрофобной организации липидных бислоев.
Взаимосвязь конформационной подвижности цитотоксинов из яда змей с их мембрано-литической активностью.
Методом МД в воде проведен сравнительный анализ конформационной подвижности петлевых участков трех цитотоксинов: ЦТ А3 из Naja atra, ЦТ2, ЦТ1 (N. Oxiana). Результаты сравнивали с данными по цитолитической активности рассматриваемых ЦТ, которая убывает в ряду A3 > ЦТ2 > ЦТ1. Показано, что подвижность петли-1 меняется в следующем порядке: А3 < ЦТ2 < ЦТ1. Напротив, стабильное состояние петли-2 (ω-образное) наблюдается у наименее цитотоксичного ЦТ1. Кроме того, показано, что ω-образная конформация петли-2 и ее стабильность в ходе МД коррелируют с наличием в петле-2 ЦТ молекулы связанной воды. Таким образом, для цитолитической активности ЦТ важны стабильная конформация петли-1 и конформационная лабильность петли-2 (точнее, её способность к адаптации – образованию т.н. «гидрофобной подошвы», необходимой для взаимодействия ЦТ с мембраной).