Подготовка научных кадров по физико-химической биологии и биотехнологии
| Вид материала | Документы |
- Институт пищевой биотехнологии и геномики Национальной академии наук Украины, 2342.88kb.
- Рабочая программа по дисциплине Аналитическая химия и физико-химические методы анализа, 414.04kb.
- Курсовой или дипломной работы в отделе эволюционной биохимии нии физико-химической, 15.25kb.
- Образовательный стандарт специальность: 170500 [240801] «Машины и аппараты химических, 187.74kb.
- 2005 –№41 Рубрика: Проблемы подготовки, сохранения и развития кадров российской науки, 99kb.
- Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии, 481.05kb.
- Решение этих проблем непосредственно связано с изучением цитоэмбриологических, физиологических, 271.54kb.
- Основанное на научных исследованиях воспроизводство научных и педагогических кадров,, 229.69kb.
- Рабочая программа дисциплины компьютерные моделирующие системы в химической технологии, 239.63kb.
- Вопросы к зачету по курсу "Основы биотехнологии", 27.24kb.
Получение библиотек ДНК на основе 10 домена фибронектина человека.
Сконструированы 2 библиотеки ДНК, кодирующие рекомбинантный ген 10 домена фибронектина человека (FN10) с заменами в петлевых участках BC, DE и FG на статистический набор аминокислот. Библиотеки различаются набором нуклеотидов в рандомизированных участках (KMT и NNB, соответственно). Полученный набор генов объединен с геном RepA и экспрессирован в бесклеточной системе. Методом CIS-дисплея с использованием биотинилированного фактора некроза опухолей (ФНО) произведен отбор генов, кодирующих ФНО-связывающие белки. В результате экспрессии в клетках E. coli методом аутоиндукции отобран ряд клонов, проявивших по результатам иммуноферментного анализа высокую степень связывания с антигеном.
Инженерия мутантных вариантов цитохрома с.
На основе анализа информационной структуры цитохрома с лошади предложена модель функционирования цитохрома, основанная на подвижности структурных блоков, соответствующих элементам информационной структуры (ЭЛИС) высшего ранга. Для подтверждения модели сконструирован ряд мутантных вариантов белка с тремя или четырьмя мутациями, содержащих cайт повышенной плотности ЭЛИС на участке 76-83 а.о. белка, что должно приводить к снижению конформационной подвижности ADD-сайта, на котором расположен остаток Met 80 цитохрома, и подавлению взаимодействия с белками-партнерами дыхательной цепи. Получены гены мутантных вариантов цитохрома, которые экспрессированы в бактериальной системе и соответствующие белки наработаны в препаративных количествах.
Получение и исследование лиганда эфриновых рецепторов ephrin A1.
Рекомбинантный эктодомен эфрина А1, лиганда эфриновых тирозин-киназных рецепторов, получен в прокариотической системе экспрессии. Разработана эффективная методика выделения и ренатурации лиганда, выход ренатурированного белка составил 50 мг/л культуры. Проведено исследование функциональной активности лиганда in vitro на клетках HEK293(EphA2-СFP), экспрессирующих химерный рецептор EphA2-СFP (СFP - циановый флуоресцирующий белок). В результате проведенных экспериментов показана способность рекомбинантного эктодомена эфрина А1 в мономерной водорастворимой форме активировать рецепторы EphA2 в клетках НЕК293.
Разработка фундаментальных принципов конструирования неприродных антител с заданными свойствами и нанокомплексов на их основе
Лаборатория молекулярной иммунологии
Продолжена разработка принципов конструирования гибридных биосовместимых наноконструкций для биоимиджинга - визуализации опухолевых клеток человека in vitro и in vivo на основе флуоресцентных наночастиц различной природы и мини-антител, специфичных к поверхностным рецепторам опухолевых клеток. Путем включения в полимерные частицы получены стабильные водные суспензии флуоресцентных нанокристаллов (квантовых точек) и их конъюгатов с противораковыми мини-антителами. В работе получен набор флуоресцентных полимерных частиц, в том числе, содержащих КТ, отвечающих требованиям биоанализа, и проведена оценка возможности использования полученных частиц для визуализации биомолекул. Показано, что включение КТ в полимерную матрицу блокирует их каналы тушения флуоресценции и дает возможность получить полимерные частицы, интенсивно флуоресцирующие в широкой области спектра от ультрафиолетовой до инфракрасной при возбуждении одним источником. Полученные частицы использованы для маркирования биомолекул на примере реакции латексной агглютинации и для визуализации клеточных рецепторов HER2/neu клеток аденомы яичника. Показано, что полученные соединения специфически метят раковые клетки SKOV3 и характеризуются высоким квантовым выходом и фотостабильностью.
Предложен новый метод конъюгации флуоресцентных наноалмазов, основанный на взаимодействии высокоафинной белковой пары барназа:барстар. Приведенная реакция проста и обеспечивает стойкое ковалентное связывание наноалмаза с барстаром. Впервые на универсальной платформе белкового модуля барназа-барстар созданы конъюгаты люминесцентных наноалмазов с флуоресцентным белком EGFP и с золотыми наночастицами. Полученные наночастицы устойчивы в виде водных суспензий в течение длительного времени, способны неспецифически метить эукариотические клетки, обладают широким спектром излучения и фотостабильностью.
В отчетном году продолжена разработка универсальной технологии создания магнитоуправляемых мультифункциональных наночастиц с заранее заданными свойствами с применением адапторного белкового модуля барназа-барстар.
На основе разработанных универсальных принципов создания неприродных антител и надмолекулярных комплексов с заранее заданными свойствами сконструированы и охарактеризованы новые высокоэффективные иммунотоксины направленного действия для адресного поражения патогенных клеток. Сконструирован и охарактеризован полностью генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор, содержащий в качестве нацеливающей молекулы анти-HER2/neu-мини-антитело 4D5scFv, а в качестве фотосенсибилизирующей – фототоксический флуоресцентный белок KillerRed. Показано, что оба домена в составе рекомбинантного белка сохраняют свои функциональные свойства – высокую аффинность к опухолевому антигену и фототоксические свойства. Рекомбинантный белок 4D5scFv-KillerRed показывает хорошую специфичность по отношению к HER2/neu-гиперэкспрессирующим раковым клеткам и эффективно снижает их жизнеспособность при облучении, а также усиливает действие противоопухолевого препарата цисплатина при сочетанном применении.
На основе другого агента, рибонуклеазы барназы, и специфического эпитопа
c-myc сконструирован и охарактеризован новый высокоэффективный иммунотоксин направленного действия для адресного поражения модельных В-клеток.
С целью создания конструкций, применимых для генной терапии, разработан молекулярный дизайн моногенных рекомбинантных конструкций, кодирующих аналоги полноразмерных антител человека противоопухолевой специфичности; исследована экспрессия указанных генных конструкций в молочных железах трансгенных мышей.
Структурно-функциональные исследования протеиназ, осуществляющих
процессинг белков и регуляцию клеточных функций.
Протеиназы социально опасных заболеваний
Лаборатория химии протеолитических ферментов
АТР-зависимый протеолиз
Продолжено изучение Lon-протеиназы из Escherichia coli (EcLon) с целью выявления особенностей сопряжения функционирования единственного нуклеотид-связывающего и двух альфа-спирализованных доменов и определения роли некаталитических областей для реализации ферментом процессивного протеолиза.
Выявлены консервативные элементы альфа-спирализованных доменов, включающих СС-участки, для LonА-протеиназ бактерий и эукариот, а также шаперонов Hsp100/ClpB. Для выявления роли остатка R164 ЕсLon-протеиназы, предположительно выполняющего сенсорную функцию, проведен направленный мутагенез гена lon, приводящий к замене R164А. Продемонстрирована экспрессия формы ЕсLon-R164А в клетках E. coli штамма BL21(DE3). Разрабатывается методика количественного выделения мутанта.
С целью предотвращения интенсивного автолиза в укороченную форму EcLon(173-784) введена мутация S679А по каталитически активному остатку серина. Охарактеризованы АТР-азная активность и олигомерное состояние мутанта.
Протеиназы экстремофилов
а) психрофильная протеиназа из микроорганизма Serratia Proteamaculans
Ограниченным протеолизом PSP с помощью химотрипсина получена укороченная форма фермента. Укороченный вариант PSP (предположительно 101-677) обладает повышенной активностью по отношению к низкомолекулярному субстрату и в отличие от полноразмерного фермента, гидролизует высокомолекулярный субстрат – азоказеин. Это подтверждает наши предположения, что N-концевая “скобка” (около 100 аминокислотных остатков), которая, по данным теоретических расчетов, удерживает конформацию каталитического домена PSP, препятствует гидролизу высокомолекулярных субстратов. Начато конструирование укороченных вариантов этого фермента, обладающих большей активностью по отношению к белковым субстратам.
Начато исследование свойств PSP в комплексе с шаперонами. Получен комплекс рекомбинантного His6-PSP - с шаперонином типа GroEL Esherishia coli (1:1).
Продолжено изучение доменной структуры PSP с помощью сканирующей микрокалориметрии. Показано, что в присутствии 50 мМ Са2+ температура денатурации двух структурно независимых доменов молекулы этого белка составляет 43,10 и 45,90. В отсутствие ионов кальция температура денатурации, соответственно, 40,20 и 44,80. Энтальпия денатурации для менее стабильного, каталитического, домена (ΔdH1) в присутствии ионов кальция также несколько повышается: с 980 до 1120 ккал/моль. Таким образом, ионы кальция несколько повышают стабильность белковой молекулы этого фермента.
б) термостабильные протеиназы из кишечника личинок жука-кожееда Dermestes maculates.
Из кишечника личинки жука-кожееда (Dermestes maculatus) выделен препарат суммарной РНК. Двухцепочечная кДНК синтезирована на матрице суммарной РНК методом SMART и амплифицирована методом PCR. Амплифицированная кДНК гена цистеиновой протеиназы L клонирована в вектор и секвенирована по одной цепи. В Определена ее нуклеотидная последовательность. Полученный фрагмент кДНК вставлен в экспрессионный вектор рЕТ22_NHis#15 для получения рекомбинантного белка (цистеиновой протеиназы L) и последующего изученияего свойств.
Механизмы эффекторного действия сериновых протеиназ на процессы воспаления и репарации тканей.
В плане исследования инактивации протеиназ активируемого рецептора (PAR1) синтезированы фрагменты PAR1 человека (PFWEDEEK-NESG) и крысы (PLGDEEEK-NESI), содержащие уникальную последовательность, аналогичную последовательности активационного пептида трипсиногена. Исследован гидролиз этих пептидов энтеропептидазой быка и легкой цепью энтеропептидазы человека. Показано, что гидролаз этих специфических для энтеропептидазы быка осуществляется легкой цепью фермента на два порядка более эффективно, чем полноразмерным ферментом.
Дуоденаза
В рамках исследования возможного участия дуоденазы как полифункциональной протеазы в защитных реакциях организма проводилось изучение действия фермента на некоторые факторы системы комплемента морской свинки и человека (С1, С4 и С3), взаимодействия дуоденазы с С1 –ингибитором и гидролиза IgG в присутствии фермента.
Показано, что в присутствии дуоденазы наблюдается дозозависимое падение гемолитической активности комплемента морской свинки, причём дуоденаза проявляет большую активность в присутствии сенсибилизированных антителами эритроцитов, чем в системе, содержащей только сыворотку. Показано, что компоненты С1 и С4 устойчивы к протеолитическому действию дуоденазы. Антикомплементарная активность фермента обусловлена инактивацией фактора С3 морской свинки дуоденазой, тогда как по отношению к С3 человека дуоденаза может проявлять активирующие свойства.
Дуоденаза образует комплекс с С1-ингибитором, который относится к классу серпинов. Разработан простой и надёжный метод определения ферментативной активности дуоденазы в диапазоне концентраций от 0,4 до 3,1 мкг/мл по гидролизу IgG.
Показана принципиальная возможность дуоденазы влиять на защитные процессы, контролируемые системой комплемента.
IgA1 протеаза из Nesseria meningitidis
Наработана IgA1 протеаза из культуральной среды и полупродуктов производства менингококковой вакцины группы А. Получены образцы рекомбинантной IgA1 протеазы и её мутантного варианта, на основе гена менингококка серогруппы В. Проведено сравнение специфичности, ферментативной активности, иммунологических и серологических свойств различных форм IgA1 протеазы. При изучении мутантного варианта IgA1 протеазы показано отсутствие её ферментативной активаности при сохранении иммуногенных свойств. В опытах на лабораторных животных показана протективная активность полученных препаратов в отношении менингококков серогрупп А и В.
Работу проводили совместно с лаб. Полимеры для биологии (Жигис Л.С.) и группой прикладных исследований пептидов и белков (Зинченко А.А.)
ВИЧ-1 протеиназа
Продолжены исследования предстационарной кинетики взаимодействия протеазы ВИЧ-1 с ингибиторами разных поколений методом остановленного потока. Получены данные, подтверждающие образование тройного комплекса протеазы, ингибитора и субстрата, которые необходимы при разработке новых высокоэффективных ингибиторов протеазы ВИЧ.
Теоретические исследования в области механизма действия протеиназ. Компонент комплемента C1q.
Продолжается работа по исследованию комплексов C1q с низкомолекулярными ингибиторами методом молекулярной динамики в модели <<гибкий лиганд – гибкий рецептор>>. Разработанный расчетный метод для ингибиторов C1q компонента системы комплемента был уточнен для лигандов, связывание которых было экспериментального определено с помощью методов иммуноферментного анализа.
Проведен сравнительный анализ точности разработанного метода и вычислительных затрат по сравнению с традиционными методами количественного анализа "структура-свойство" (QSAR).
Синтез и биологическая активность индолсодержащих липидов
Лаборатория оксилипинов
В рамках общей программы синтеза новых индолсодержащих биоэффекторных липидов в 2011 г. проведен синтез гибридных нейролипинов, содержащих остатки 5-метокси- и 5-гидрокситриптамина, присоединенные к этаноламиду арахидоновой кислоты (анандамиду) и арахидоноилглицину. Изучены биологические свойства синтезированных соединений, а также веществ сравнения из семейства ацилнейротрансмиттеров.
Показано, что производные 5-метокси- и 5-гидрокситриптаминов обладают менее выраженным нейрозащитным действием по сравнению с аналогичными производными дофамина. Однако в модели фотоиндуцированного тромбоза головного мозга комбинация N-эйкозапентаеноил-5-гидрокситриптамина и N-арахидоноилдофамина существенно уменьшала зону поражения мозга, что было подтверждено ультраструктурными исследованиями срезов головного мозга крыс. Этот эффект превосходил нейрозащитное действие каждого из нейролипинов в данной модели.
В опытах по определению возможного цитотоксического действия синтезированных соединений на клетки глиомы С6 крысы установлено, что гибридные соединения на основе анандамида и триптаминов обладают заметной ингибирующей активностью (EC50 несколько мкМ), тогда как амиды арахидоноилглицина с триптаминами оказались практически неактивными в данном тесте. Однако цитотоксическое действие производных триптамина оказалось значительно слабее эффектов производных дофамина. Последние, как наиболее активные нейролипины, были изучены в более сложных моделях повреждения нейронов. Так, совместно с НЦ Неврологии РАМН изучено нейропротекторное действие N-докозагексаеноилдофамина на органотипические срезы гиппокампа мыши в модели глутаматной токсичности и установлено, что добавление этого нейролипина к срезам, предварительно обработанным 200 мкМ глутамата (это в контроле вызывает значительное повреждение нервных клеток), оказывает существенный нейрозащитный эффект. Такой же эффект наблюдали и в экспериментах на первичной культуре коры головного мозга крысы: присутствие N-докозагексаеноилдофамина в концентрации 5мкМ в инкубационной среде приводило к максимальному увеличению количества выживших нейронов (практически 100%). N-арахидоноилдофамин в такой же концентрации также защищал максимальное количество нейронов (92%) от токсического действия глутамата. Этот эффект дозозависимым образом усиливался в присутствии N-эйкозапентаеноилсеротонина (наиболее активного соединения из изученных производных триптаминов).
Совместно с Нижегородской медицинской академией изучено влияние N-докозагексаеноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность нейронной сети первичной культуры гиппокампа крысы. Показано, что добавление этого нейролипина в концентрации 20 мкМ в культуральную среду на фоне действия глутамата, приводит к постепенному снижению уровня активности нейронной сети и наблюдается изменение сетевого паттерна биоэлектрической активности с эффектом более быстрого восстановления синхронизированной пачечной активности после периода молчания по сравнению с нейронной сетью, в которую добавлялся только глутамат в концентрации 50 мкМ. Следовательно, N-докозагексаеноилдофамин способен модулировать биоэлектрическую активность нейрональной сети, частично восстанавливая характерный паттерн, нарушенный под действием глутамата.
Отдельной серией экспериментов показано, что профилактическое введение N-арахидоноилдофамина перед моделированием острой гипобарической гипоксии снижало смертность среди мышей, способствовало сохранению долговременной памяти в постгипоксическом периоде, снижало неуверенность и тревожность животных.
Кроме того, продолжено изучение биологических свойств природных простамидов (амидов простагландинов с биологически активными аминами). Совместно с институтом фармакологии РАМН показано, что арахидоноил-гамма-аминомасляная кислота способна усиливать мозговое кровообращение в условиях раздельной и сочетанной сосудистой патологии мозга и сердца. Подобным эффектом обладал также амид простагландина E2 и гамма-аминомасляной кислоты (природный аналог простамида E2), причем этот эффект был чувствителен к ингибиторам рецепторов гамма-аминомасляной кислоты и не проявлялся в отсутствии патологии. Таким образом, запланированные на 2011 г. исследования в рамках пункта 46 основных направлений фундаментальных исследований РАН полностью выполнены: за отчетный период были синтезированы новые биологически активные соединения, близкородственные природным нейролипинам, и найдены новые свойства природных биоэффекторных липидов, важные в плане разработки новых лекарственных средств для лечения социально значимых заболеваний.
Синтез новых противоопухолевых веществ липидной природы, создание и исследование форм их адресной доставки в опухоли
Лаборатория химии липидов
Синтезированы по разработанным ранее методикам липофильные пролекарства (ЛП) метотрексата и мелфалана, а также липофильный гликоконъюгат тетрасахаридного лиганда селектинов Sialyl Lewis X (SiaLeX) – вектор для получения адресных лекарственных липосом.
Разработан синтез флуоресцентного BODIPY-меченого аналога диглицеридного производного метотрексата – зонда для изучения внутриклеточного транспорта липофильного пролекарства метотрексата. Рукопись статьи подготавливается.
Исследован противоопухолевый эффект адресных липосом с ЛП новых антимитотических агентов – блокаторов тубулина – на модели рака молочных желез мышей. Показано, что ЛП 4-арилкумаринового аналога природного агента комбретастатина А4 (СА-4) в липосомальной форме превосходит как исходный 4-арилкумариновый аналог, так и липосомальную форму ЛП СА-4. Проведен ряд экспериментов по изучению внутриклеточного трафика лекарственных липосом. В качестве модельного ЛП использовали диглицеридное производное доксорубицина (DOX-DG), поскольку DOX обладает собственной флуоресценцией. Сравнивали внутриклеточный трафик липосом различного состава: нагруженных DOX во внутреннем водном объеме и несущих DOX-DG в мембране. По полученным данным, липосомы с ЛП легче высвобождают лекарство в клетке, чем «стандартные» липосомы с препаратом во внутреннем объеме.
Исследовано взаимодействия липосом с ЛП метотрексата и мелфалана с компонентами крови человека. Изучение гемосовместимости включало тесты на гемолиз, коагуляцию и активацию системы комплемента. Показано, что липосомы с ЛП мелфалана, в том числе, оснащенные Sialyl Lewis X, не влияют на перечисленные показатели крови. В то же время, для липосом с ЛП метотрексата наблюдалась активация системы комплемента (начального компонента С3а и конечного мембраноатакующего комплекса) и коагуляции. Эти нежелательные эффекты минимизировались при уменьшении нагрузки липосом ЛП (при сохранении суммарной концентрации ЛП в анализируемом образце).
Впервые исследована локализация лекарственных SiaLeX-липосом (ЛП – диглицеридное производное мелфалана) in vivo, на модели карциномы легких Льюис. Показано, что в отсутствие адресного лиганда липосомы накапливаются во внеклеточном пространстве опухолевой ткани за счет пассивного транспорта, в то время как введение SiaLeX-конъюгата в состав липосом обеспечивает их активный транспорт к эндотелию опухолевых сосудов, вызывая повреждение последних.
Синтез новых флуоресцентных зондов; изучение с их помощью строения и функций мембран и закономерностей переноса энергии возбуждения; изучение апоптотических процессов в клетках.
Лаборатория химии липидов
Синтезированы новые флуоресцентные зонды: BODIPY-FL-, BODIPY-564/570-производные фосфатидилэтаноламина, производные PEG-2000-дипальмитоил-фосфатидилэтаноламина, меченные остатками Rhodamane-Red-X и Texas-RedX, зонды применены для изучения распределения меченых фосфатидилэтаноламинов в липидных бислоях различной кривизны. Также синтезирован антрилвинил (AV)-меченый сульфатид, примененый для изучения свойств мутантного специфического к сульфатиду гликолипид-переносящего белка. С применением AV-меченого церамида исследованы закономерности межмембранного перенос церамидов. С использованием ранее синтезированных AV-меченых гликолипидов проведено дальнейшее изучение строения и функций гликолипид-переносящего белка.
Проведено изучение структуры ДНК/липидных комплексов в связи с эффективностью трансфекции. Найдено, что эффективнее те комплексы, в которых ДНК сильнее экранирована.
Изучено взаимодействие некоторых цитотоксинов змей с фосфолипидными мембранами разного состава. Найдено, что при таком связывании определяющую роль играют полярные группы фосфатидилсерина.
Синтезированы флуоресцентные субстраты фосфолипазы А2, предназначенные для исследования роли этого фермента в развитии патологических процессов при инфаркте миокарда.
Изучено включение в липосомы фенантролиновых комплексов европия и их цитотоксичность в опытах in vitro.