Подготовка научных кадров по физико-химической биологии и биотехнологии
| Вид материала | Документы |
- Институт пищевой биотехнологии и геномики Национальной академии наук Украины, 2342.88kb.
- Рабочая программа по дисциплине Аналитическая химия и физико-химические методы анализа, 414.04kb.
- Курсовой или дипломной работы в отделе эволюционной биохимии нии физико-химической, 15.25kb.
- Образовательный стандарт специальность: 170500 [240801] «Машины и аппараты химических, 187.74kb.
- 2005 –№41 Рубрика: Проблемы подготовки, сохранения и развития кадров российской науки, 99kb.
- Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии, 481.05kb.
- Решение этих проблем непосредственно связано с изучением цитоэмбриологических, физиологических, 271.54kb.
- Основанное на научных исследованиях воспроизводство научных и педагогических кадров,, 229.69kb.
- Рабочая программа дисциплины компьютерные моделирующие системы в химической технологии, 239.63kb.
- Вопросы к зачету по курсу "Основы биотехнологии", 27.24kb.
Структурно-функциональные исследования природных и синтетических пептидов и оценка перспективности их использования для биохимических и медицинских исследований
Лаборатория химии пептидов
На основании исследований активности пептидных экстрактов из растений на клеточных линиях А549 и Н1299 (рак легких человека), линии HeLa (рак шейки матки человека), на клетках линий MCF-7 и MCF-10 РМЖ, HT1080 (фибросаркома человека) получен экстракт смеси растений, которые могли бы обеспечить цитостатическую активность на всех клеточных линиях. Проведен масс-спектроскопический анализ пептидов смеси растений и пептидов каждого растения смеси. Показано, что экстракт смеси растений содержит не менее 20 компонентов, молекулярная масса которых не превышает 1000 Д. С помощью специально созданной программы PeptIdent показано, что некоторые молекулярные массы компонентов экстрактов растений совпадают с молекулярными массами фрагментов белков, обладающих противоопухолевой активностью. На клеточных линиях проводятся работы по исследованию цитостатической активности полученного экстракта.
Синтез и структурно-функциональные исследования иммуномодуляторов класса мурамилпептидов для разработки новых иммунобиологических препаратов для профилактики и иммунотерапии
Лаборатория химии пептидов
Изучение механизма действия ГМДП.
Показано, что совместное введение ГМДП и ОDN в физиологическом растворе ингибировало продукцию антител к овальбумину, причем эта же доза ГМДП, введенная отдельно обладала адъювантным эффектом, а ODN в используемой дозировке – нет. Сделано заключение, что для демонстрации синергизма адъювантного действия ГМДП и ODN необходимы дополнительные исследования для подбора их оптимального соотношения.
Показано, что при совместном введении манноза не ингибирует адъювантный эффект ГМДП и, следовательно, ее рецепторы не входят, как предполагалось, в систему транспортных белков ГМДП.
Изучение механизма протективного действия ГМДП в мышиной модели аллергической бронхиальной астмы.
Проведено исследование влияния мурамилдипептидов в модели мышиной бронхиальной астмы методом ПЦР-анализа с обратной транскрипцией на индукцию провоспалительных цитокинов. Показано, что превентивная иммунизация ГМДП на стадии формирования аллергической реакции в дыхательных путях предотвращала воспаление и ослабляла Th2-опосредованный проаллергический ответ. Несмотря на уменьшение аллергической реакции при действии ГМДП, проявлявшееся в уменьшении эозинофилии и IgE-иммуноглобулиномии, продемонстрировано увеличение уровня экспрессии генов цитокинов IL-4, IL-10, IL-13.
Изучение механизмов мукоадъювантного действия низкомолекулярных хитозанов. Для синтеза конъюгатов использовали В-клеточные (Asp f 2 47-58, Asp f 2 254-268, Asp f 3 1-15 и Asp f 3 47-61) и Т-клеточные (Asp f 2 235-249 и Der p 2 21-35) эпитопы белков-аллергенов из грибов Aspergillus fumigatus и клещей домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus и фракцию олигосахаридов хитозана с М.м. 23 кДа и степенью дезацетилирования 85%.Способность свободных пептидов и их конъюгатов с хитозаном стимулировать образование антител была изучена на мышах линии BALB/c. Мышей 5-кратно иммунизировали либо подкожно, либо интраназально указанными соединениями в ФФР. Продукцию антител оценивали методом ИФА с использованием в качестве подложки исходных пептидов. Анализ антительного ответа показал, что иммунизация данными конъюгатами приводила к избирательному синтезу противопептидных IgG1 антител. Встраивание в конъюгат дополнительного Т-эпитопа одновременно с В-эпитопом также приводило к усилению иммунного ответа на целевой В-эпитоп.
Структурно-функциональное изучение флуоресцентных белков для разработки новых технологий флуоресцентного мечения в живых системах
Лаборатории Молекулярных технологий и Биофотоники, Инновационный центр Технопарк ИБХ
Структурно-функциональные исследования флуоресцентных белков.
С помощью химического синтеза модельных соединений были изучены возможные механизмы созревания красного хромофора флуоресцентных белков DsRed-типа. Был разработан метод синтеза 5-арилиден-3,5-дигидро-4H-имидазол-4-онов, соответствующих хромофору зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent Protein) c ациламиноалкильными заместителями в положении 2 имидазолона. По сути, такие соединения представляют собой GFP хромофор с фрагментом предшествующей белковой цепи, что позволяет моделировать созревание хромофоров красных флуоресцентных белков из предшественников с зеленым хромофором. Было обнаружено, что эти модельные соединения легко реагируют с молекулярным кислородом с образованием DsRed-подобных хромофоров и продуктов их дальнейшего распада. Наши данные впервые показали, что GFP-подобный хромофор склонен к окислению по С-альфа атому аминокислоты в положении 65 (GFP хромофор формируется аминокислотными остатками в положениях 65-67). Единственным требуемым фактором такого окисления являются щелочные условия. Следует отметить, что условия автоокисления были сходны с таковыми при созревании флуоресцентных белков. Так, для модельных соединений с небольшими заместителями автоокисление проходило за 20 мин при комнатной температуре, что сопоставимо со скоростью созревания многих красных флуоресцентных белков. Мы заключили, что в случае красных флуоресцентных белков, созревающих через GFP-подобный интермедиат (таких как z2FP574 и asFP595), роль белкового окружения в формировании красного хромофора сводится к основному катализу.
Наши результаты проливают свет на эволюцию флуоресцентных белков. Ранее было показано, что цветовое разнообразие GFP-подобных белков возникало независимо в различных группах животных. В частности, многократное возникновение красных флуоресцентных белков и хромобелков с химически идентичным DsRed-подобным хромофором представляет собой интригующий пример конвергентной эволюции на молекулярном уровне. Легкость окисления GFP хромофора по положению 65, продемонстрированная в нашей работе, помогает объяснить эту загадку, показывая, что превращение зеленого хромофора в красный – не такой сложный процесс, как думали ранее.
Наконец, наши результаты позволяют задать парадоксальный вопрос: почему не все флуоресцентные белки являются красными? Возможно, только отсутствие сильных основных групп вблизи положения 65 поддерживает стабильность зеленого хромофора. Следовательно, введение аминокислотных остатков, способных играть роль основания, в непосредственно близости от С-альфа атома в положении 65 представляет собой новый подход к созданию красных флуоресцентных белков на основе существующих зеленых флуоресцентных белков.
Разработка и применение новых генетически кодируемых сенсоров.
Недавно нами была получена улучшенная версия сенсора пероксида водорода HyPer, содержащая замену A233V в регуляторном домене OxyR, названная HyPer2. HyPer2 характеризовался увеличенным динамическим диапазоном по сравнению с исходным вариантом. Однако, время окисления и восстановления HyPer2 было заметно больше, чем для HyPer. В ходе настоящей работы мы получили еще одну мутантную форму HyPer, которая содержала замену H114Y в OxyR. Динамический диапазон флуоресцентного ответа на пероксид водорода сенсора HyPer-H114Y был в 3 раза выше, чем у исходного сенсора HyPer. Вместе с тем, оба сенсора имели сходные скорости окисления и восстановления. Таким образом, был получен улучшенный вариант сенсора HyPer. С помощью сенсора HyPer нами была изучена динамика продукции H2O2 макрофагами RAW264.7, фагоцирующими гранулы опсонизированного сывороткой зимозана. Из результатов предыдущих исследований продукции H2O2 макрофагами RAW264.7 опсонизированного полисахарида клеточной стенки дрожжей зимозана (Opz) следует, что концентрация H2O2 начинает расти через несколько минут после добавления к клеткам Opz, достигает максимума через 40 мин и постепенно снижается. Снижение концентрации до исходной не наблюдается в течение нескольких часов. Все подобные исследования ранее проводились только для популяции фагоцитов, в том числе макрофагов RAW264.7.Используя высокоселективный к H2O2 флуоресцентный краситель Amplex UltraRed, мы также получили кривую, отражающую продукцию H2O2 популяцией фагоцитирующих RAW264.7. Таким образом, наша экспериментальная система представляет собой «классическую» модель для исследования динамики окислительного взрыва при фагоцитозе.Для визуализации окислительного взрыва в индивидуальных макрофагах использовали клетки RAW264.7, транзиентно экспрессирующие HyPer цитоплазматической локализации (HyPer-Cyto). Для получения серий изображений отдельных фагоцитирующих макрофагов применяли конфокальную флуоресцентную микроскопию. Наблюдение за индивидуальными клетками позволило установить, что концентрация H2O2 внутри клетки начинает расти немедленно после захвата гранулы Opz, достигает максимума через 2 минуты, и возвращается на исходный уровень через 10-15 минут. В некоторых клетках происходит более одного транзиентного повышения уровня продукции внутриклеточного H2O2, причём можно проследить корреляцию между моментами поглощения отдельных гранул Opz и последующими «всплесками» продукции H2O2. Полученные нами графики продукции H2O2 в индивидуальных фагоцитрующих макрофагах радикально отличаются от аналогичных графиков для популяций клеток. Разницу между результатами, полученными с помощью HyPer, и графиками продукции АФК популяцией макрофагов RAW264.7, полученных с применением люминола и Amplex UltraRed, можно объяснить асинхронностью и гетерогенностью профилей продукции H2O2 индивидуальных клеток. Быстрое окисление и восстановление HyPer во время фагоциза может свидетельствовать о сигнальной функции H2O2 в этом процессе.
Разработка технологий флуоресцентного мечения живых систем
Разработан новый метод количественного анализа альтернативного сплайсинга целевого экзона на уровне отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии.
Предлагаемый метод направлена на анализ альтернативного сплайсинга кассетных экзонов, пропуск (или вставка) которых приводит к сдвигу рамки считывания (т.е. длина экзона не кратна 3). Согласно литературным данным, такие экзоны встречаются в более чем 1/3 всех альтернативно сплайсированных транскриптов млекопитающих. Таким образом, предлагаемый метод применим к большому числу генов. Для остальных экзонов, можно использовать искусственное изменение длины альтернативного экзона на 1 или 2 нуклеотида. Метод основан на экспрессии генетических конструкций, кодирующих фрагмент целевого гена и флуоресцентные белки двух цветов (например, красного и зеленого). Согласно схеме, химерная конструкция организована следующим образом. Фрагмент целевого гена (миниген), включающий в себя альтернативный экзон (AEn), соседние интроны (I) и конститутивные экзоны (E), расположен между генами красного и зеленого флуоресцентных белков с сохранением открытой рамки считывания экзонов:
rfp-E(n-1)-I(n-1)-AEn-In-E(n+1)-gfp. Таким образом, трансляция нормально сплайсированного трансткрипта приводит к появлению красного и зеленого флуоресцентных белков. В случае альтернативного сплайсинга с пропуском альтернативного экзона, образуется сдвиг рамки в экзоне E(n+1), что ведет к синтезу только красного (но не зеленого) флуоресцентного белка.
Клетки, экспрессирующие данную конструкцию, проявляют красную и зеленую флуоресценцию, яркость которой можно измерить с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Отношение красного и зеленого сигналов может быть использовано для вычисления соотношения нормального и альтернативного транстриптов в каждой клетке. Для этого используется контрольная конструкция, соответствующая нормальному трансткрипту без интронов, которая показывает соотношение красного и зеленого сигналов в случае 100% нормального сплайсинга. Дополнительный красный сигнал сверх этого значения соответствует альтернативному транскрипту. Данная схема была успешно применена для анализа сплайсинга экзона 4 гена PIG3 человека.
Разработанный метод обладает следующими преимуществами:
1) Схема расположения флуоресцентных белков делает возможным количественный анализ альтернативного сплайсинга через оценку флуоресцентных сигналов. Ранее предложенные методы на основе флуоресцентных белков не позволяли вычислять соотношение транскриптов в каждой клетке.
2) Анализу подвергается большой фрагмент неизмененного целевого гена, что сводит к минимуму вероятность потери важных регуляторных последовательностей. Ранее предложенные аналогичные методы не давали возможность включать в анализируемую конструкцию соседние экзоны или требовали включения генов флуоресцентных белков в состав альтернативного экзона, что может изменять регуляцию альтернативного сплайсинга.
Посттрансляционные модификации белков семейства GFP
Группа химии хромопротеинов
Разработан метод установления структуры флуоресцентных белков объединяющий гомологичное моделирование in silico для определения общей пространственной структуры белка и эксперименты in vitro для установления структуры хромофора. Экспериментальное установление структуры хромофора включает в себя выделение из белка небольшого хромофорсодержащего пептида и последующий его масс-спектрометрический анализ. Включение структуры хромофора в рассчитанную модель белка позволяет получить полную пространственную структуру исследуемого белка. С использованием данного метода проведены работы по изучению пространственной структуры желтого флуоресцентного белка phiYFP. Полученная модель на следующем этапе использовалась для определения аминокислот в окружении хромофора, которые могут влиять на фотофизические свойства белка, и по этим аминокислотам проводился направленный мутагенез. Анализ спектральных свойств полученных мутантов показал, что несколько факторов определяют фотофизические характеристики желтых флуоресцентных белков. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что π-π стэкинг-взаимодействия хромофора с фенольным кольцом Tyr203 вносят лишь небольшой вклад (около 10 нм) в общий сдвиг спектров в красную область. Дополнительный эффект может быть получен при введении Val в позиции 205. Также, важным фактором является образование водородной связи между Glu222 и азотом имидазолонового цикла хромофора.
Исследование пространственной организации и структурно-функциональной взаимосвязи белков методами рентгеноструктурного анализа, биоинформатики, молекулярной механики/динамики
Лаборатория рентгеноструктурного анализа
Методом рентгеноструктурного анализа на атомном уровне установлены пространственные структуры высокого разрешения (в интевале 1.15 - 1.85 Å) красного флуоресцентного белка дикого типа eqFP578 (из морского анемона Entacmaea quadricolor, эм = 578 нм) и его дальне-красного генно-инженерного варианта Katushka (эм = 635 нм) при различных рН. Установлена взаимосвязь между структурными особенностями исследованных белков и спектральными характеристиками. Структурно-функциональные выводы подтверждены результатами сайт направленного мутагенеза.
Координаты атомов четырех новых кристаллических структур депонированы в Международный структурный банк белков с кодами доступа PDB_ID: 3PIB (eqFP578 pH5.5), 3PJB (eqFP578 pH4.0), 3PJ7 (Katushka pH8.5), 3PJ5 (Katushka pH5.0).
Показано, что пространственная организация мономера исследованных флуоресцентных белков (ФБ) принимает форму закрытого с торцов β-бочонка сформированного из 11-ти антипараллельных бета-сегментов и одной альфа-спирали, в центре которой располагается хромофор, образованный в результате посттрансляционной модификации аминокислотной триады Met63-Tyr64-Gly65. Хромофор представляет собой планарную бициклическую систему сопряжённых двойных связей, сформированную из пятичленного имидазолонового и фенольного циклов. Двойная ацилиминная связь С=N Met63, расположенная в плоскости хромофора, дополнительно расширяет эту систему, приводя к наблюдаемому сдвигу флуоресценции из зеленой в красную область спектра. Аминокислотные остатки ближайшего окружения хромофора (в пределах 4Å) образуют развитую сеть водородных связей. Посредством водородных связей сеть активно взаимодействует с хромофором, формируя эффективную транспортную систему для электронов и протонов как при созревании хромофора (в процессе посттрансляционной модификации), так и флуоресценции.
Уникальной особенностью исследуемых дальне-красного варианта Katushka, также предшественника дикого типа eqFP578, является ярко выраженная рН зависимость флуоресценции с максимумом эмиссии при рН ~6-8, которая постепенно падает до нуля при уменьшении рН до ~3–4. В этой связи, пространственная организация eqFP578 и Katushka была установлена при двух значениях рН, отвечающих низкому и высокому уровням флуоресценции. Установлено, что флуоресцентные состояния eqFP578 и Katushka отвечают соответственно транс и цис конформациям хромофора, отличающимися поворотом боковой цепи Tyr хромофора на 180 град вокруг связи СА-СВ. Было показано, что наблюдаемое тушение флуоресценции при понижении рН у eqFP578 (от pH5.5 к pH4.0) и Katushka (от pH8.5 к pH5.0) сопровождается противоположной транс-цис и цис-транс изомеризацией хромофоров, соответственно. Анализ пространственных структур выявил три замены, Asn143Ser, Phe174Leu и His197Arg, которые оказались ключевыми при конструировании варианта Katushka (~635нм) из предшественниеа дикого типа eqFP578 (эмиссия при ~578нм). Именно остатки Ser143, Leu174 и Arg197, расположенные вблизи хромофора, оказались ответственными за транс-цис изомеризацию хромофора и, как следствие, желаемый сдвиг флуоресценции в дальне-красную область спектра у Katushka. Остаток Ser143 вносит существенный вклад в стабилизацию цис формы за счет образования водородной связи с гидроксильной группой остатка Tyr хромофора. В свою очередь, остатки Leu174 и Arg197 предположительно дестабилизируют транс форму, сдвигая равновесие в пользу цис формы. При этом, более низкоэнергетичная цис форма хромофора дает основной вклад в наблюдаемый сдвиг максимума эмиссии в дальне красную область спектра (от 578нм к 635нм).
Исследование генома и протеома яда паукообразных и растений с целью идентификации новых биологически-активных веществ, взаимодействующих с клеточной мембраной.
Лаборатория нейрорецепторов и нейрорегуляторов
Показано, что пуротоксин-1 (PT-1) в наномолярных концентрациях значительно уменьшает активацию рецептора АТФ, стабилизируя стадию десенситизации рецептора. Кроме того, PT1 оказывает анальгетическое действие в моделях воспалительной боли и может рассматриваться как перспективный анальгетик направленного действия. В результате анализа баз данных EST ядовитых желез различных пауков были найдены гены, кодирующие полипептиды, гомологичные PT1 и содержащие около 70% идентичных аминокислотных остатков. Были получены 7 рекомбинантных аналогов PT1, для чего были синтезированы гены, получены конструкции для экспрессии на основе вектора рЕТ32, подобраны условия экспрессии, выделены гибридные белки с тиоредоксином, проведено их расщепление с использованием каталитической субъединицы энтерокиназы человека, проведена очистка целевых пептидом методом ВЭЖХ. Действие аналогов PT1 было проверено на P2X2, P2X3 и P2X2/3 рецепторах, экспрессируемых в DRG нейронах крысы. Из 7 аналогов три оказались неактивными, один пептид в концентрации ~100 nM ингибировал P2X2-опосредованные токи, три аналога проявляли стойкий ингибирующий эффект на P2X3 рецепторы, один аналог незначительно потенцировал токи, опосредованные P2X2/3 рецепторами. Новые модуляторы P2X могут быть использованы как для фундаментальных целей, таких как исследование специфичности и структурно-функциональных особенностей пуриновых рецепторов, так и для клинического использования.
Продолжена работа по тестированию биологических и химических образцов на присутствие в них компонентов, способных модулировать активность рецепторов ASIC3, экспрессированных в ооцитах лягушки Xenopus laevis, а также характеристике новых выделенных соединений. В ходе работы:
- Установлена структура полипептида ASTX1 из морской анемоны Heteractis crispa, который ингибирует активность ASIC3 рецептора (IC50 ~10 мкМ). ASTX1 (молекулярная масса 4537 Да) состоит из 41 аминокислотного остатка, среди которых 6 остатков цистеина, которые образуют между собой 3 дисульфидные связи. Ближайшими гомологами ASTX1 являются пептиды из морской анемоны Anthopleura elegantissima: APETx1- блокатор K+ каналов и APETx2 – известный селективный модулятор ASIС3 каналов.
- Из актинии Utricina grebelnyi (район обитания п-ов Камчатка) выделен пептид (М.м 3135Дa), вызывающий уменьшение как пикового, так и стационарного компонента токов через ASIC3 каналы.
- Проведено тестирование ядов 6 тропических актиний (Индонезия). В концентрациях 1мг/мл какого-либо эффекта на активность ASIC3 рецепторов не обнаружено. Установлено, что яд зоантарии Protopalythoa sp. оказывает очень сильное и стойкое цитолитическое действие на мембрану ооцита, которое обусловлено пептидными компонентами с молекулярной массой около 2000Да.
- выделен низкомолекулярный компонент из экстракта чабреца ( Thymus sp.), ингибирующий активность ASIC3 рецептора (IC50 ~ 300 мкМ).
- Проведено тестирование действия 13 образцов водных экстрактов морских червей в концентрации 1мг/мл на ASIC3 рецепторы: 2 образца оказывают концентрационно-зависимое ингибирование пикового компонента токов через ASIC3 каналы; один компонент вызывает концентрационно-зависимое потенциирование пикового компонента и ингибирование стационарного компонента токов через ASIC3 каналы.
- Проведено тестирование действия 41 алкалоида растений (Уфа) на ASIC3 рецепторы: три соединения оказывают концентрационно - зависимое ингибиторное действие на пиковый компонент токов через ASIC3 каналы.
С целью создания эффективной клеточной тест-системы получена стабильная линия клеток CHO, экспрессирующая рецептор rTRPV1 под контролем тетрациклин-зависимого промотора CMV. Используя метод флуоресцентной спектроскопии в комбинации с применением планшетного спектрофотометра с интегрированной автоматической системой дозирования жидкостей NOVOstar (BMG LABTECH) и прибора RT-PCR (ДНК-Технология), проведена характеристика рецептора, изучены ответы клеток на приложение различных агонистов TRPV1 рецептора (капсаицин, 2APB, рН, температура). Разработан метод скрининга, основанный на измерении Са2+ сигнала клеток, индуцируемого при стимуляции клеток агонистами TRPV1 рецептора, без и в присутствии различных тестируемых соединений. Проведено исследование действия ранее описанных анальгетических пептидов APHC1-3 из анемоны Heteractis crispa в различных схемах активации рецептора TRPV1. Показано, что пептиды APHC1-3, в отличие от капсазепина - известного низкомолекулярного блокатора TRPV1 каналов, не вызывают значительного падения Са2+ ответа клеток при однократной активации клеток капсаицином, а также при приложении рН=6.0-5.5 и повышенной температуры (44˚С), однако, при применении слабого активационного стимула (рН~6.5, 2АРВ) APHC1-3 значительно изменяют кальциевый ответ на последующий капсаициновый стимул. Полученные данные свидетельствуют в пользу более сложного механизма действия пептидов, затрагивающего различные переходные состояния рецептора во время активации-десенсетизации. Таким образом, показано, что данная клеточная система может быть использована для быстрого скрининга и поиска новых активных соединений по отношению к TRPV1-рецепторам, в том числе соединений, проявляющих модулирующую активность.
Проведено тестирование ядов 6 тропических (Индонезия) и 3 холодостойких (Камчатка) актиний на наличие в них компонентов, активных по отношению к TRPV1-рецепторам. Определены яды 3-х видов актиний для дальнейшего фракционирования и тестирования отдельных соединений.
Проведено исследование физиологических эффектов полипептидных модуляторов TRPV1 рецептора пептидов APHC1 и APHC3 из анемоны Heteractis crispa на сократительную активность ГМ детрузора нормальных крыс и крыс с диабетической моделью синдрома гиперактивности мочевого пузыря (СГАМП).
Известно, что TRPV1-экспрессирующие, капсаицин-чувствительные афферентные нервные волокна, которыми иннервирован мочевой пузырь, осуществляют как сенсорную, так и “эфферентную” функции. При этом сенсорная функция состоит в регуляции частоты мочеиспускания и восприятии болевых ощущений, а “эфферентная” – преимущественно в контроле сократимости гладких мышц (ГМ) детрузора. Одной из основных дисфункций мочевой системы является синдром гиперактивного мочевого пузыря (СГАМП) различного происхождения. Частой причиной развития СГАМП бывают изменения в нервной системе, вызванные сахарным диабетом. При СГАМП плотность TRPV1 иммунореактивных нервных волокон возрастает, а активаторы или блокаторы TRPV1 рецепторов способствует снижению клинических симптомов.
Эксперименты проводили методом тензометрии на препаратах детрузора с удаленным уротелием, которые характеризовались наличием спонтанных сокращений. АРНС1 и АРНС3 применяли в концентрации 200 нМ. Оба пептида у здоровых крыс вызывали временное повышение базального тонуса продолжительностью 13-15 мин, на фоне которого наблюдалось также значительное увеличение амплитуды спонтанных сокращений. По мере воздействия пептиды постепенно угнетали сокращения в ответ на 10-секундные ритмические электрические раздражения интрамуральных нервов. Угнетение выходило на стационарный уровень на 30-й мин и достигало для АРНС1 - 38,50±3,42% (n=5), а АРНС3 – 25,08±1,63% (n=5).
В модели экспериментального диабета АРНС1 и АРНС3 оказывали незначительное влияние на базальный тонус и спонтанную сократительную активность ГМ детрузора, но сильнее ингибировали вызванные сокращения. Максимальное угнетение последних наблюдалось на 30-й мин воздействия и составляло для АРНС1 46,28±3,26 % (n=5), а для АРНС3 – 43,87±1,81 % (n=5). Таким образом, в модели диабетического СГАМП у крыс угнетающее действие на вызванные сокращения ГМ детрузора пептидов-модуляторов TRPV1 выражено более сильно. Полученные данные свидетельствуют, что АРНС1 и АРНС3 могут рассматриваться как эффективные ингибиторы TRPV1-зависимой сократимости ГМ мочевого пузыря, особенно при СГАМП.
На основе ранее предложенного метода представления аминокислотных последовательностей в упрощенной форме - Single Residue Distribution Analysis была разработана информационная схема анализа банков нуклеотидных последовательностей. В соответствии с новым подходом проводился предварительный анализ мотивов аминокислотных последовательностей для полипептидных токсинов морских анемон, в результате чего было впервые предложено 14 различных мотивов их первичной структуры. Качество разработанных мотивов и их пригодность к дальнейшему использованию при анализе проверялось на референсной базе полипептидных последовательностей, где с помощью них удалось идентифицировать все представленные в этой базе полипептидные токсины морских анемон. Простота и эффективность SRDA методики при поиске полипептидных токсинов в банке EST была продемонстрирована на примере анализа базы данных EST из морской анемоны Anemonia viridis. Постадийный анализ всех имеющихся 39939 просеквенированных клонов позволил детектировать закодированные в транскриптоме 5 белков предшественников ранее известных токсинов, 43 новых полипептидных токсина и еще 39 вероятных полипептидных токсинов. Также было обнаружено два белка предшественника, которые продуцируют новые пептиды с предположительно нейротропной активностью.
Проведен эволюционный анализ последовательностей токсин-кодирующих EST паука Agelena orientalis. Ранее (2005-2007) был исследован пептидом яда этого паука. В частности, был проведен расчет соотношения частоты синонимичных и несинонимичных замен (dS/dN) как для полных последовательностей EST, так и для последовательностей, кодирующих сигнальные пептиды, пропептиды и зрелые цепи в отдельности. Было показано, что во всех перечисленных случаях с высоким уровнем статистической значимости (> 0,95) наблюдается повышенная частота несинонимичных замен по сравнению с синонимичными. Преобладание несинонимичных замен наиболее выражено в последовательностях, соответствующих зрелым токсинам, и наименее выражено в последовательностях, соответствующих сигнальным пептидам. Эти факты свидетельствуют о наличии положительного отбора в токсин-кодирующих генах и согласуются с литературными данными для токсинов из других ядовитых животных. Кроме того, для этих же последовательностей было рассчитано соотношение числа транзиций и трансверсий. Была обнаружена повышенная частота транзиций по сравнению с трансверсиями, что не согласуется с опубликованными данными для токсинов из других ядовитых организмов, в частности, конических моллюсков.
Создана исчерпывающая база данных α-токсинов скорпионов, воздействующих на процесс инактивации потенциал-чувствительных натриевых каналов, которая содержит информацию об их структуре и активности. Совместно с лабораторией моделирования биомолекулярных систем проведен анализ созданной базы. Показано, что α-токсины можно представить как составленные из двух «псевдодоменов»: консервативного «корового» и вариабельного «RC-домена». Этим структурам свойственны три главных признака доменов: обособленность структурная, функциональная и эволюционная. В настоящее время функцией RC-домена считают придание токсину определенной специфичности действия. Токсины, специфичные в отношении насекомых, характеризуются значительно более высокой гидрофобностью и низкой подвижностью RC-домена в сравнении с токсинами, активными против млекопитающих. Полученные данные будут использованы для рационального дизайна токсинов с заданной специфичностью.
Из яда паука Oxyopes takobius (Oxyopidae) получен новый цитолитический пептид оксиопинин 4a (Oxt 4a). Установлена полная аминокислотная последовательность Oxt 4a из 30 остатков. Пептид содержит единственную дисульфидную связь в N-концевой области (Cys4-Cys10) и отличается от всех ранее изученных компонентов яда пауков. В сотрудничестве с лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии показано, что Oxt 4a неупорядочен в растворе, однако приобретает характерную торпедообразную структуру при взаимодействии с мицеллами детергента, состоящую из «головы» (остатки 1–11 с необычно высокой концентрацией положительного заряда) и «тела» (остатки 12–25 формируют амфифильную α-спираль). Осуществлен химический синтез Oxt 4a. Новый пептид характеризуется широким спектром цитолитической и антимикробной активности. Oxt 4a, отличаясь от других пептидов из яда пауков, проявляет поразительное сходство с пептидами из кожи амфибий с так называемым мотивом "Rana-box". Параллелизм или конвергенция проявляется на нескольких уровнях: структура, функция и биосинтез пептидов из этих различных источников сходны.
Из яда того же паука O. takobius выделен уникальный полипептидный токсин OtTx 1a (~12 кДа), проявляющий инсектицидную и антимикробную активности. Комбинация методов белковой химии, масс-спектрометрии и генной инженерии позволила установить полную аминокислотную последовательность OtTx 1 из 108 остатков. Первичная структура OtTx 1 позволяет отнести его к новому семейству так называемых модульных токсинов пауков. N-Концевой линейный модуль OtTx 1 соответствует «обычному» цитолитическому пептиду. С-Концевой модуль содержит 5 дисульфидов и, вероятно, формирует укладку «цистинового узла», характерную для большинства нейротоксинов пауков. С помощью экспрессии синтетических генов в бактериальной системе получен полноразмерный рекомбинантный токсин OtTx 1a, а также его С-концевой модуль. Кроме того, путем химического синтеза был получен N-концевой модуль OtTx 1. Проведено исследование инсектицидной и антимикробной активности полноразмерного OtTx 1 и его частей. Обнаружено, что С-концевой модуль характеризуется высокой цитолитической активностью, превосходящей известные аналоги.
Продолжена работа по разработке способа борьбы с внутриклеточными паразитами (хламидиями Chlamydia trachomatis) с использованием конструкций, кодирующих гены АМП из яда пауков. Совместно с лабораторией генной инженерии Научно-исследовательского института физико-химической медицины Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию изучен антихламидийный эффект пептида из яда паука Lachesana tarabaevi – цито-инсектотоксина CIT1a, который представляет собой линейный, катионный, амфифильный, -спиральный пептид, активный в отношении как Грам-положительных, так и Грам-отрицательных бактерий.
Антихламидийная активность синтетического пептида CIT1a была продемонстрирована на (а) элементарных тельцах (ЭТ) C.trachomatis; (б) с использованием стратегии регулируемой экспрессии гена cit 1a в инфицированной клетке. Показано, что цито-инсектотоксин CIT1a действует на ЭТ C.trachomatis при довольно высокой концентрации - 100 мкМ, что согласуется с литературными данными по тестированию биологической активности на хламидиях дефензинов и протегринов, и, по-видимому, объясняется особенностями строения наружной оболочки ЭТ и структурной жесткостью ЭТ, которая определяется чрезвычайно сшитой природой комплекса белков наружной мембраны.
Для изучения активности CIT1a по отношению к хламидийной инфекции в инфецированной клетке был сконструирован рекомбинантный плазмидный вектор, в котором последовательность, кодирующая зрелую цепь CIT1a находится под контролем тетрациклин-зависимого промотора CMV, а также в состав вектора входит ген трансактиваторного белка rtTA. Продемонстрирована антихламидийная активность пептида CIT1a после трансфекции рекомбинантного вектора pBI/rtTA/CIT1a в культуре клеток линии HEK 293. Уровень ингибирования инфекции C.trachomatis составил около 80%, что превосходит ингибирующий эффект мелиттина, продемонстрированный ранее. При этом цито-инсектотоксин CIT1a обладает менее выраженным цитотоксическим действием по сравнению с мелитином. C использованием различных схем заражения клеток и индукции экспрессии гена, впервые показано, что антимикробная активность цито-инсектотоксина реализуется на ранней стадии развития хламидийной инфекции.
Продолжены исследования по выделению и структурно-функциональному анализу новых антимикробных пептидов растений. Из семян и цветков одуванчика (Tarahakum officinale) выделено и изучено частично или полностью 26 пептидов, среди которых имеются таковые с новым цистеиновым мотивом. Из цветков этого дикорастущего растения также выделен и охарактеризован гликозилированный Pro/HyPro-богатый пептид.
Продолжены исследования пептидов семян ежовника обыкновенного ( Echinochloa crusgalli). Выделено пять новых пептидов с 4-Сys мотивом. Из листьев выделен один пептид гевеиного типа и несколько пептидов с 4-Cys мотивом. Выполнена работа по пептидомному анализу различных органов одуванчика и звездчатки (Stellaria media). Методами ЯМР в растворе определена (совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН) пространственная структура антимикробного пептида EcAMP1 семян ежовника обыкновенного (Echinochloa crusgalli), выделенного ранее совместно с группой молекулярных основ иммунитета растений ИОГен РАН. Методами лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии изучено взаимодействие пептида со спорами гриба Fusarium solani.
Определены последовательности кДНК и генов, кодирующих предшественник пептида WAMP-1 (гевеин-подобный антимикробный пептид с широким спектром антимикробной и антигрибковой активности), ранее выделенного из семян пшеницы Triticum kiharae, и шесть его близких гомологов. Предшественники пептидов состоят из сигнального пептида, зрелого пептида и С-концевого продомена. Гены, кодирующие пептиды WAMP, не содержат интронов. Анализ последовательностей кДНК позволил предположить происхождение генов wamp из генов хитиназ. По-видимому, в результате делеции и сдвига рамки считывания был утерян каталитический домен хитиназы, что привело к появлению генов wamp. Биотические и абиотические факторы влияют на экспрессию генов wamp. Солевой стресс и взаимодействие с разными патогенными грибами приводит к индукции экспрессии, что предполагает важную роль пептидов WAMP в ответе на стресс. Так, при взаимодействии проростков пшеницы с патогенным грибом Aspergillus niger меняется не только уровень, но и профили экспрессии генов wamp. Впервые показана экспрессия генов гевеин-подобных АМП в ответ на солевой стресс.