Подготовка научных кадров по физико-химической биологии и биотехнологии
| Вид материала | Документы |
- Институт пищевой биотехнологии и геномики Национальной академии наук Украины, 2342.88kb.
- Рабочая программа по дисциплине Аналитическая химия и физико-химические методы анализа, 414.04kb.
- Курсовой или дипломной работы в отделе эволюционной биохимии нии физико-химической, 15.25kb.
- Образовательный стандарт специальность: 170500 [240801] «Машины и аппараты химических, 187.74kb.
- 2005 –№41 Рубрика: Проблемы подготовки, сохранения и развития кадров российской науки, 99kb.
- Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии, 481.05kb.
- Решение этих проблем непосредственно связано с изучением цитоэмбриологических, физиологических, 271.54kb.
- Основанное на научных исследованиях воспроизводство научных и педагогических кадров,, 229.69kb.
- Рабочая программа дисциплины компьютерные моделирующие системы в химической технологии, 239.63kb.
- Вопросы к зачету по курсу "Основы биотехнологии", 27.24kb.
Механизмы взаимодействия Cys-петельных рецепторов с природными и синтетическими токсинами
Отдел молекулярных основ нейросигнализации
Лаборатория рецепции нейропептидов
Получены новые кристаллические структуры комплексов ацетилхолин-связывающих белков со стрихнином и d-тубокурарином, показаны различные ориентации этих антагонистов в центрах связывания, а также возможность расположения двух молекул стрихнина в одном и том же кармане связывания. На основании этих данных был предложен механизм молекулярного распознавания стрихнина и тубокурарина различными представителями Cys-петельных рецепторов и были продолжены работы по созданию новых уточненных компьютерных моделей этих рецепторов, включая глициновый и серотониновый, а также различных подтипов никотиновых холинорецепторов. Компьютерное моделирование α3β4α5 типа никотинового рецептора дало возможность по-новому оценить его роль в чувствительности к никотину. Компьютерные модели были использованы также для дизайна и последующего синтеза новых аналогов альфа-конотоксина PnIA из морских моллюсков семейства Conus а их биологические исследования выявили соединения, значительно превосходящие природный альфа-конотоксин по активности. В совместной работе с Отделом биоинженерии и Отделом структурной биологии впервые получен гетерологически экспрессированный водорастворимый аналог природного трехпетельного белка Lynx1 (эндогенного модулятора никотиновых холинорецепторов), методом ЯМР определена его структура в растворе и получены параметры его взаимодействия с некоторыми типами холинорецепторов и ацетилхолин-связывающими белками. Впервые показано, что взаимодействие с никотиновыми рецепторами мышечного типа происходит в участке связывания классических антагонистов, а с нейрональными – вне его.
Новые полипептиды животных ядов, действующие на Cys-петельные рецепторы и гемостаз
Лаборатория молекулярной токсинологии
Проведено клонирование и установлены нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих аминокислотные последовательности нескольких фосфолипаз А2 из яда степной гадюки Vipera ursinii. Эти фосфолипазы выделены из яда и изучено их влияние на процесс сворачивания крови. В яде этой же гадюки обнаружен белок с молекулярной массой 13,8 кДа, обладающий способностью взаимодействовать с никотиновыми холинорецепторами. Определена N-концевая аминокислотная последовательность этого белка, оказавшаяся гомологичной последовательностям трех-петельных токсинов. Также из яда V. ursinii выделен токсичный для насекомых белок, N-концевая аминокислотная последовательность которого гомологична таковой легкой цепи активатора фактора X из яда гадюки V. ammodytes. Кроме того выделены две металлопротеиназы, одна из которых расщепляет фибриноген, препятствуя таким образом нормальному процессу сворачивания крови. Показано наличие гликозилирования металлопротеиназ и активатора фактора Х.
Создание новых лигандов Cys-петельных рецепторов на основе пептидных токсинов: конструирование, синтез, активность
Лаборатория лиганд-рецепторных взаимодействий
С помощью компьютерного моделирования был осуществлен направленный дизайн большой серии аналогов альфа-конотоксина PnIA. 14 новых аналогов были синтезированы и была проведена оценка их способности взаимодействовать с нейрональным никотиновым холинорецептором альфа7 типа и ацетилхолин-связывающими белками. Три из них показали более высокое сродство и селективность к определенной мишени. Были получены их радиоактивные формы, сохранившие свои связывающие свойства и потенциально пригодные для использования в качестве маркеров соответствующих мишеней. Для надежной детекции альфа3/альфа6 нейрональных холинорецепторов проведен синтез аналогов α-конотоксина MII, различающихся модификациями по N-концевому остатку для получения радиоактивных производных, а также его флуоресцентного аналога. Все они были охарактеризованы в биохимических тестах и на физиологическую активность и признаны годными в качестве маркеров данного типа рецепторов. Охарактеризована также холинергическая активность гетерологически экспрессированного водорастворимого эндогенного модулятора некоторых типов никотинового холинорецептора – белка Lynx1.
Исследование механизма действия биокатализаторов, ферментов, каталитических антител, компонент протеосомного комплекса
Лаборатория биокатализа
Методами предстационарной кинетики исследован механизм деградации фосфорорганических соединений, в частности пестицидов каталитическими антителами. Показаны стадии реакции разложения ФОВ, пестицида параоксона.
Подтверждены данные кинетической схемы, полученной на предыдущем этапе исследования. Показано, что она соответствует трехстадийной реакции с участием стадии ковалентного катализа. Реакция протекает по механизму «индуцированного соответствия».
Подтверждены данные, полученные на предыдущем этапе, демонстрирующие, что именно с наличием субьединиц иммунопротеасомы связан альтернативный механизм деградации ключевого нейроантигена, основного белка миелина. Высказано предположение, что деградация основного белка миелина иммунопротеасомой не столь сильно зависит от уровня убиквитилирования.
Проведено детальное исследование механизма действия протеазы ВИЧ. Методами предстационарной кинетики установлен механизм взаимодействия ингибиторов с протеазой ВИЧ. Получены элементарные константы взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами. Детализированы «элементарные стадии процесса» Построена кинетическая модель механизма действия.
Показано с помощью анализа библиотеки генов иммуноглобулинов больных рассеянным склерозом, что в репертуаре этих иммуноглобулинов имеется ответ как на нейроантиген, основной белок миелина, так и на белки вируса Эпштейна-Барра. Таким образом, впервые продемонстрировано наличие «молекулярной росписи» вируса в репертуаре больного РС.
Идентификация и структурно-функциональные исследования новых белков, участвующих в патогенезе ряда социально-значимых заболеваний. Разработка на их основе подходов для диагностики и лечения этих заболеваний
Лаборатория белков гормональной регуляции
Изучение взаимодействия NDP-киназы A сетчатки быка и легкой цепи динеина типа 1.
Ферментативная активность нативной NDP-киназы в препаратах НСП, а также уровень ее аутофосфорилирования при взаимодействии с рекомбинантным DYNLRB1 возрастали в 1,5 раза по сравнению с контролем. При исследовании зависимости величины активации и уровня аутофосфорилирования рекомбинантной NDP-киназы А от концентрации DYNLRB1 было показано, что максимальное 10-кратное увеличение активации фермента наблюдалось при соотношении молярных концентраций белков 1:10 соответственно, а максимальное 5-кратное увеличение уровня его аутофосфорилирования достигалось при соотношении их концентраций 1:30. Таким образом, DYNLRB1 влияет на обе стадии ферментативной реакции, катализируемой NDP-киназой А. В системе E. сoli были экспрессированы цитоплазматические домены активинов 1 и 2 — серин/треониновых протеинкиназ из семейства TGF β рецепторов. Показано, что фосфорилирование DYNLRB1 активинами в системе in vitrо не происходит. Однако, включение радиоактивного фосфата в состав DYNLRB1 наблюдалось при совместной инкубации белков в
препаратах НСП, при этом фосфорилирование DYNLRB1 вызывало дополнительную 2-кратную активацию NDP-киназы А. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фосфорилирование DYNLRB1 является важным процессом, регулирующим его взаимодействие с NDP-киназой А, а также о том, что помимо активинов 1 и 2 для фосфорилирования DYNLRB1 необходимы дополнительные факторы.
Изучение функциональной роли нейротрофного фактора из пигментного эпителия PEDF при возникновении миопии.
Ранее нами был проведен анализ ряда последовательностей кДНК PEDF из склеры близоруких глаз. В трех случаях были обнаружены мутации, затрагивающие полученный из образцов контрольной группы, и PEDF обнаруженных мутантных форм были экспрессированы в бакуловирусной системе. Изучение свойств экспрессированных белков показало, что мутантные формы PEDF не отличаются от контрольных образцов по способности подвергаться протеолизу под действием матриксной металлопротеазы-2. Исследование же с помощью атомно-силовой микроскопии и высоко специфических антител на олигомерные структуры показало, что экспрессированные белки не отличаются также и по способности к фибриллообразованию.
Выяснение функциональной роли в клетках иммунной системы новых белков (гапонин и YM-1).
Для изучения функциональной роли гапонина была создана панель генетически модифицированных клеточных линий с измененными уровнями экспрессии белка. С помощью лазерной конфокальной микроскопии клеток, сверхэкспрессирующих слитый белок GFP-гапонин, и иммунофлуоресцентного окрашивания эндогенного гапонина было показано, что гапонин, имеющий в своей аминокислотной последовательности сайты ядерной локализации, преимущественно находится в клеточных ядрах. С помощью клеток, сверхэкспрессирующих гапонин дикого типа, и клеток, в которых уровень экспрессии гапонина был снижен методом киРНК, было установлено, что клеточная гибель в условиях окислительного стресса, вызываемого добавлением к клеткам экзогенного пероксида водорода, и метаболического стресса, вызываемого депривацией сыворотки, прямо коррелирует с количеством гапонина в клетке. Полученные данные об участии гапонина в молекулярных механизмах клеточного ответа на окислительный стресс в совокупности с ранее продемонстрированной способностью гапонина связывать GAPDH, позволили предположить, что гапонин способствует ядерной транслокации GAPDH в условиях окислительного стресса и усилению сигнального каскада GAPDH/Siah1/клеточная гибель.
Определена полная нуклеотидная последовательность гена, кодирующая открытый нами белок rYM-1olf обонятельного эпителия крысы. Полноразмерная кДНК rYM-1olf крысы (включающая 1545 п.о.) депонирована в международную базу данных
GenBank. Для выяснения роли белков rYM-1olf и р45 (Sec14р) крысы при воспалении проводили сравнение уровней экспрессии их мРНК в клетках обонятельного эпителия животных с синдромами острого и хронического воспалений. Результаты ПЦР-анализа в реальном времени показали, что количество транскриптов гена rYM-1olf в ткани животных в случае острого воспаления в первые сутки увеличивалось в 22,6 раза (p<0,05), а гена rSec14р в 5,4 раз (p<0,05) по сравнению с контролем; а на седьмые сутки не отличалось от контроля. Морфологические исследования тканей печени и тимуса подтверждали, что к 7 суткам животные выздоравливали. У животных с хроническим воспалением уровень экспрессии этого гена был невысоким. Таким образом, острое воспаление сопровождается резким увеличением экспрессии гена rYm1olf, а накапливание rYm1olf в тканях является индикатором развития воспаления. Экспрессия гена Сhi3l3, кодирующего белок Ym1olf в крысе экспериментально подтверждена впервые. Также показано отсутствие экспрессии в обонятельной выстилке крыс гена Сhi3l4, наиболее близкого к изучаемому крысиному гену.
Исследование молекулярного механизма нейропротекторного действия пептида HLDF-6.
Изучено влияние пептида HLDF-6 на рабочую память животных с моделями болезней Альцгеймера. Было использован две модели: 1) трансгенные мыши линии B6C3- Tg(APP695)85Dbo,Tg(PSENI)85Dbo, экспрессирующие белок пресенилин 1 и предшественник амилоидного белка (экспрессия двух белков обеспечивает раннее развитие болезни Альцгеймера, обусловленное отложением в мозге бета-амилоидных образований); и 2) крысы, у которых болезнь Альцгеймера вызывали при помощи инъекции бета-амилоида 25-35 и иботеновой кислоты в гиппокамп. Рабочую память животных тестировали в модели спонтанного чередования в У-образном лабиринте. Индекс спонтанного чередования, являющийся показателем рабочей памяти, в случае животных обеих моделей был значительно ниже, чем у животных контрольных групп. Инъекции пептида HLDF-6 восстанавливали рабочую память, как у трансгенных мышей, так и у крыс с болезнью Альцгеймера, вызванную введением бета-амилоида и иботеновой кислоты, до уровня контрольных животных.
Структура и функции белков ядрышек клеток млекопитающих
Лаборатория структурной биохимии
С помощью полученных нами противопептидных антител проведен анализ нуклеофозмина в нормальных тканях крыс (мозге, печени, почках, сердце, легких). Впервые показано, что наибольшее содержание нуклеофозмина в мозге и печени. Из этих тканей получены более обогащенные нуклеофозмином препараты ядер, анализ которых позволил впервые выявить, что мозг, в отличие от других тканей, содержит помимо мономерных олигомерную форму нуклеофозмина;
Анализ нуклеофозмина в лимфоидных клетках здоровых доноров, больных со злокачественными и незлокачественными заболеваниями крови позволил впервые выявить, что при злокачественных заболеваниях крови основные изменения касаются олигомеров белка, детектируемых противопептидными антителами к С-концевому домену изоформы В23.1, локализованных в ядрышке. Увеличение содержания этих олигомеров коррелировало с увеличением содержания Ki-67 позитивных клеток.
Методами иммунопреципитации и аффинной хроматографии с использованием полученных нами моноклональных антител к белку ядрышка SURF-6 и оригинальных генетических конструкций, кодирующих кДНК Surf-6-GST, установлено, что основными белковыми партнерами SURF-6 в клетках HeLa являются факторы процессинга рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 – нуклеофозмин, Nop52 и EBP-2. Взаимодействие SURF-6 с нуклеофозмином и Nop52 подтверждено также методом FRET в живых клетках. Эти результаты говорят о том, что одной из функций SURF-6 у млекопитающих является участие в биогенезе рибосом и, возможно, в развитии вирусных инфекций, происходящих с участием белка EBP-2.
На полученных нами ранее генетически модифицированных фибробластах мыши линии NIH/3T3-174 показано, что индуцированное повышение содержания SURF-6 приводит к достоверному уменьшению продолжительности клеточного цикла в целом и фазы репликации ДНК (S-периода), в частности. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу участия белка SURF-6 в регуляции клеточного цикла и, возможно, его стимуляции. С использованием метода Нозерн блотов доказано, что индуцированное повышение содержания SURF-6 в клетках NIH/3T3-174 SURF-6 приводит к нарушениям биогенезе рибосом. Таким образом, суммируя полученные результаты можно сделать вывод о том, что основными функциями белка ядрышка SURF-6 являются участие в биогенезе рибосом и регуляции клеточного цикла.
Методом высокочувствительной гибридизации in situ проведен анализ состоянии незрелых форм пре-рРНК и зрелых рРНК в митозе у млекопитающих (на примере, фибробластов мыши NIH/3T3. Доказано, что инкубация митотических клеток с кальциевым ионофором А23187 индуцирует преждевременную (на стадии метафазы) сборку NDF у млекопитающих. Эти наблюдения указывают на то, что ионы кальция играют важную роль в реорганизации ядрышка в митозе. Проанализировано влияние различных параметров, включая площадь ROI (region of interest) и температурные условия постановки эксперимента, на мобильность белков в экспериментах с использованием метода FRAP (fluorescence recovery after photobleaching). Впервые показано, что стандартизация площади ROI необходима для получения воспроизводимых результатов в независимых сериях экспериментов. Анализ подвижности белков ядрышка при физиологической (37о С) и пониженной (27о С) температуре позволяет выявить белки, обладающие энзиматической активностью.
Совместно с группой экспериментальной биологии с виварием) продолжена работа по разработке лабораторной модели склеродермии человека – патологии иммунной системы, сопровождающихся выработкой аутоантител к антигенам ядрышка. Показано, что нелинейные (аутбредные) мыши CFW под действием хлорида ртути развивают системный аутоиммунный процесс, характеризующийся совокупностью типичных признаков системной склеродермии: появлением аутоантител к белку ядрышка фибрилларину, увеличением уровня сывороточных иммуноглобулинов классов IgG1 и IgE, образованием герминативных центров в селезенке, отложением иммунных комплексов в клетках почек, печени и селезенки. Впервые показано, что аутоантитела, вырабатываемые аутбредными животными, способны проникать внутрь клеток, что характерно также для больных такими аутоиммунными заболеваниями как системная красная волчанка и склеродермия.
В рамках выполнения НИР по ГК №14.740.11.0116 была разработана методика выявления сайтов активности РНК-полимеразы I на криосрезах яичников мышей после гормональной стимуляции.
В культуральном фильтрате недавно описанного гриба Fusarium asiaticum, распространённого в Китае и вызывающего фузариоз пшеницы, впервые были идентифицированы пектолитические ферменты (пектинметилэстераза, полигалактуроназа, пектинлиаза). Пектолитические ферменты фитопатогенных грибов, разрушающие пектин клеточной стенки и участвующие в процессе заражения растения грибом, являются основными патогенными факторами в системе гриб – растение-хозяин. Особенностью клеточной стенки пшеницы и других злаковых является низкое содержание пектина, поэтому участие пектолитических ферментов грибов в процессе заражения пшеницы находится на стадии изучения. Ранее зарубежными учёными было сделано предположение, что ферменты, разрушающие клеточную стенку растения, являются важными патогенными факторами близкородственного гриба Fusarium graminearum. В культуральном фильтрате гриба Fusarium asiaticum были идентифицированы три формы пектинметилэстеразы (ПМЭ). Две формы ПМЭ с молекулярной массой 31 и 42,5 кДа были очищены до гомогенности. Эти формы не связываются с конканавалином А. Кроме того, было показано, что ПМЭ с молекулярной массой 31 кДа термостабильна в интервале температур 25 – 55 0С, а оптимум рН - 6,5.
Изучение структурно-функциональной организации и инженерия
рекомбинантных белков для медицины и биотехнологии
Отдел биоинженерии
Разработка бесклеточной системы продукции интегральных мембранных белков
Разработаны системы бесклеточной продукции бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum и мускаринового ацетилхолинового рецептора типа М1. Для бесклеточной продукции мембранных белков в растворимой и функциональноактивной форме был опробован новый подход: синтез в присутствии мембраномоделирующих сред, таких как мицеллы детергентов, бицеллы, липосомы и липид-белковые нанодиски. Сравнительный анализ функциональной активности бактериородопсина, синтезированного в присутствии различных мембранных миметиков, показал, что наибольший выход активного белка в растворимой форме наблюдается при ко-трансляционном встраивании бактериородопсина в липид-белковые нанодиски. В случае мускаринового ацетилхолинового рецептора человека М1 типа наибольший выход белка наблюдался при бесклеточном синтезе в виде осадка трансляционной смеси в отсутствие каких-либо мембраномоделирующих компонентов. Разработан протокол ренатурации рецептора в результате его солюбилизации из осадка трансляционной смеси и последующего встраивания в липосомы. Эксперименты по взаимодействию с лигандами атропином и телензипином показали наличие функциональной активности полученного препарата рецептора.
Получение и исследование проапоптозного белка Noxa.
Разработана эффективная система продукции проапоптозного белка Noxa в Escherichia coli. Оптимизированы условия выращивания бактерий и достигнут уровень синтеза около 100 мг/л в богатой автоиндукционной среде и 50 мг/л в бедной среде. Разработан протокол выделения и очистки белка, который включает две стадии металлохелатной аффинной хроматографии и ионообменную хроматографию. Выделены миллиграммовые количества 15N-меченного Noxa и получены ЯМР-спектры в различных экспериментальных условиях В 15N-HSQC спектрах белка, растворенного в 20 мМ буфере Трис при различных рН, присутствуют всего 11 кросс-пиков. Это говорит о том, что большая часть белка Noxa не структурирована. По косвенным данным можно сделать вывод о том, что на спектре виден N-концевой участок белка (совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии).
Изучение эффективности и специфичности расщепления энтеропептидазой слитных белков с мутациями в сайте расщепления D4K.
Разработан новый эффективный подход для удаления аффинных и других тагов с помощью каталитической субъединицы энтеропептидазы при получении рекомбинантных белков различного назначения. Каталитическая субъединица энтеропептидазы широко используется для высокоспецифичного расщепления слитных белков и удаления аффинных тагов, однако, при использовании большого количества фермента часто происходит расщепление и других участков полипептидной цепи, что ухудшает качество целевого препарата. Проведенные исследования показали, что эффективность расщепления слитных белков энтеропептидазой существенно улучшается при замене аминокислотного остатка K в сайте расщепления D4K на R. При этом требуется в 4-6 раз меньше рекомбинантной энтеропептидазы чем при использовании исходного (природного) сайта расщепления. Уменьшение количество используемого фермента позволяет снизить стоимость полученного целевого белка, что особенно важно при масштабном получении рекомбинантных белковых препаратов.
Конструирование и получение рекомбинантных Fab’-фрагментов антител против протективного антигена и летального фактора B. Anthracis.
Осуществлено выделение генов вариабельных доменов моноклональных антител, обладающих нейтрализующей активностью в отношении протективного антигена (ПА) и летального фактора (ЛФ) экзотоксина B. anthracis и предотвращающих развитие инфекционного процесса при заражении бациллами сибирской язвы. Проведено конструирование химерных (каппа, IgG1) Fab’-фрагментов антител против ПА и ЛФ, а также их гуманизированных аналогов, у которых осуществлена замена мышиных каркасных FR-доменов антиген-связывающего центра на FR-домены человека. Разработана система бактериальной экспрессии и проведено выделение химерных и гуманизированных фрагментов антител. По результатам иммунохимического анализа показано, что процесс химеризации и гуманизации не повлиял на антиген-связывающие свойства, и аффинность рекомбинантных химерных и гуманизированных антител полностью совпадает с данными, полученными для моноклональных антител. Таким образом, полученные рекомбинантные антитела против ПА и ЛФ могут быть использованы для разработки терапевтических средств для борьбы с сибирской язвой.