Подготовка научных кадров по физико-химической биологии и биотехнологии
| Вид материала | Документы |
- Институт пищевой биотехнологии и геномики Национальной академии наук Украины, 2342.88kb.
- Рабочая программа по дисциплине Аналитическая химия и физико-химические методы анализа, 414.04kb.
- Курсовой или дипломной работы в отделе эволюционной биохимии нии физико-химической, 15.25kb.
- Образовательный стандарт специальность: 170500 [240801] «Машины и аппараты химических, 187.74kb.
- 2005 –№41 Рубрика: Проблемы подготовки, сохранения и развития кадров российской науки, 99kb.
- Энерго- и ресурсосберегающие процессы в химической технологии, нефтехимии и биотехнологии, 481.05kb.
- Решение этих проблем непосредственно связано с изучением цитоэмбриологических, физиологических, 271.54kb.
- Основанное на научных исследованиях воспроизводство научных и педагогических кадров,, 229.69kb.
- Рабочая программа дисциплины компьютерные моделирующие системы в химической технологии, 239.63kb.
- Вопросы к зачету по курсу "Основы биотехнологии", 27.24kb.
Получена серия замещенных по амидной группе производных рибавирина – потенциальных противовирусных нуклеозидов.
Проведены работы по получению серии новых модифицированных нуклеозидов с помощью генно-инженерных ферментов нуклеозидфосфорилаз исходя из 21 новых гомологов 1,2,4-триазол-3-карбоксамида, замещённых по 5-ому положению гетероцикла и (или) по амидной. Углеводная часть молекул представлена: рибозой, 2’-дезоксирибозой или 3’-дезокси-3’-амино-рибозой. Проведены работы по изучению физико-химических свойств экспериментальных образцов целевых нуклеозидов, созданы сертификаты соответствия и наработаны препараты для скрининга противовирусной активности полученных соединений.
Разработка технологий производства терапевтических препаратов в эукариотических клетках
Лаборатория биотехнологии
Получение клеточной линии rhuFSH/IK, экспрессирующей человеческий ФСГ на основе линии клеток яичника китайского хомячка СНО К1 DXB11.
Исходным материалом для создания продуцента ФСГ служила линия клеток яичников китайского хомячка СНО К1 DXB11, полученная из Российской коллекции клеточных культур (РККК) при Институте Цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Основатель линии -Dr. Lawrence Chasin (Колумбийский Университет, Нью-Йорк, США). Исходную линию культивирровали в среде F12 с добавлением 10% FBS (эмбриональная телячья сыворотка) как адгезионную культуру при 370С с 5% содержанием СО2. Пересев осуществляют 0.25% раствором трипсина каждые 2-3 дня с кратностью рассева 1:10 или 5х105 клеток на флакон с поверхностью 25 см2. В клеточной линии СНО К1 DXB11 одна аллель гена dhfr делетирована, другая подверглась мутации с потерей функции. Линия ауксотрофна по гипоксантину или аденину, глицину, тимидину и пролину. Фермент дегидрофолатредуктаза (DHFR) катализирует редукцию 5, 6-дигидрофолата дo 5, 6, 7, 8-тетрадегидрофолата, необходимого для синтеза ДНК. Клетки линии СНО К1 DXB11 не обладают активностью DHFR и растут только в среде с добавлением пуриновых предшественников гипоксантина и тимидина, пока они стабильно не трансфецированы вектором, содержащим ген dhfr. Линию СНО К1 DXB11 адаптировали к росту в среде ДМЕМ с добавлением 1:100 100х раствора антибиотики/антимикотики (А/А), 2 mM глутамина, 1:100 100x раствора заменимых аминокислот, 1:50 50х добавки HT, содержащей гипоксантин и тимидин (все среды и добавки фирмы Invitrogen, США). Линию тестировали на отсутствие активности DHFR (дегидрофолатредуктазы) , то есть ауксотрофность по гипоксантину и тимидину: исключение добавки HT из среды приводило к постепенной остановке деления и последующей гибели клеток. Линию также проверяли на отсутствие микоплазменной контаминации окрашиванием флюоресцентными красителями ДНК DAPI и Hoechst.
Экспрессионные плазмиды pcDNA/FSH и pOptiVEC/FSH котрансфецировали в клетки линии CHO К1 DXB11 методом липосомальной трансфекции. После двойной селекции в селекционной среде определённого химического состава не содержащей гипоксантина и тимидина с добавлением селекционного агента генетицин (G418) получают пул стабильно трансфецированных клеток. Дальнейшую амплификацию экспрессионных кассет осуществляли посредством культивироваия клеток в присутствии возрастающих доз (50-100 нМ) метотрексата (МТХ). Полученный пул клеток, устойчивый к МТХ, клонировали методом лимитирующих разведений. Полученные из единичных клеток клоны анализировали методом иммуноферментного анализа. Выбирают 5-6 клонов с максимальным уровнем секреции ФСГ. Отобранные клоны тестировали по таким параметрам, как уровень и стабильность экспрессии целевого белка, а также адаптируемость к росту и продуции ФСГ в суспензии. Отобранный клон с начальной продуктивностью не менее 12 МЕ/мл, размножали на ранних пассажах (3-5) и сохраняли методом криоконсервирования для последующего создания мастер банка.
Культуральные свойства
Клетки клона выращивали в среде ДМЕМ с добавлением 1:100 100х раствора антибиотики/антимикотики (А/А), 2 mM глутамина, 1:100 100x раствора заменимых аминокислот (Gibco), 10% диализованной FBS (Sigma), 100 нМ метотрексата (МТХ , Sigma) при 370, 5% СО2 как адгезионную культуру. Пересев монослоя осуществляли 0.25% раствором трипсина с кратностью 1:10 каждые 3-4 дня. Начальный фенотип К1, присущий родительской линии, подтвержден отсутствием роста в среде, не содержащей пролин. Подтверждено отсутствие грибов, бактерий и микоплазмы в культуре. Продукцию человеческого ФСГ определяли методами ИФА и иммуноблота.
Продукция ФСГ сохраняется на начальном уровне, по крайней мере, в течение 30 пассажей (3-х месяцев) при культивировании с МТХ (в селективных условиях) и, по крайней мере, в течение 15 пассажей (1.5 месяцев) без МТХ (в неселективных условиях), что указывает на высокую стабильность геномных копий целевых генов. Высокая стабильность позволяет сделать заключение о создании линии, потенциально применимой в фармацевтической промышленности для производства лекарственных форм ФСГ. Линия получает название rhuFSH/IK.
Продуктивность суспензионной культуры после адаптации к росту в суспензии в бессывороточных средах составляет 18 МЕ/106 клеток в день, что в 1.5 раза превышает продуктивность ранее созданных продуцентов ФСГ, описанных выше.
Конструирование экспрессионных плазмид и эффективных бактериальных и дрожжевых продуцентов полипептидов медицинского назначения, обладающих антибактериальной, антивирусной и противоопухолевой активностью
Лаборатория биотехнологии
Блок антиангиогенных рекомбинантных полипептидов, состоящий из фрагментов природных ингибиторов ангиогенеза (эндостатина, тумстатина и пигментного эндотелиального фактора), создан с помощью генно-инженерных технологий. Вначале осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование в Esherichia coli искусственных генов, кодирующих фрагмент тумстатина Tum8 (69 – 95), фрагмент PEDF (24 – 57) и фрагмент эндостатина (1 – 49). Сконструированы: рекомбинантная плазмида, содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные последовательности фрагмента PEDF (24 – 57); плазмида, содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные последовательности фрагмента эндостатина (1 – 49) и плазмида, содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные последовательности фрагмента фрагмента тумстатина Tum8 (69 – 95). Созданы высокоэффективные штаммы-продуценты и наработаны опытные партии целевых пептидов.
Исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Для подтверждения антиангиогенной активности полученных пептидов был проведен стандартный комплекс тестов, позволяющий оценить действие пептидов на ранних этапах ангиогенеза (пролиферация эндотелиальных клеток и образование капилляроподобных структур). Антиангиогенные свойства пептидов PEDF(44–77), эндостатин (1-49) и тумстатин (L69K-95) были изучены в диапазоне концентраций от 20 нМ до 0,1 нМ. В работе использовали иммортализованную культуру эндотелиальных клеток (ЭК) мыши SVEC-4-10. В исследованиях in vitro все три пептида продемонстрировали способность подавлять начальные этапы ангиогенеза. Были определены эффективные концентрации препаратов для дальнейших испытаний in vivo: 10 нМ для эндостатина (1-49) и тумстатина (69-95), 1 нМ для PEDF (44-77).
Биологическая активность тестируемых пептидов изучалась in vivo на моделях заболеваний глаз, протекающих с ангиогенезом. Исследования проводились совместно с сотрудниками отделения офтальмологии ЦКБ РАН. В работе использовали две модели неоваскуляризации роговицы кролика для оценки антиангиогенной активности тестируемых пептидов на разных стадиях развития патологического процесса. С помощью первой модели анализировали способность препаратов предупреждать развитие патологической неоваскуляризации: пептиды вводили в глаза животных одновременно с индукцией ангиогенеза. Вторая модель позволяла выявить аваскулогенный эффект пептидов, т. е. их способность резорбировать вновь образованные сосуды, и оценить эффективность препаратов на более поздних стадиях развития заболевания. В этом эксперименте пептид вводили в глаз через 8 дней после индукции ангиогенеза, когда сосудистая сеть частично сформирована.
Первую модель ангиогенеза формировали путем прошивания роговицы с лимба викриловыми швами. Все 3 антиангиогенных пептида оказывали сопоставимый клинически значимый антиангиогенный эффект, который проявлялся в том, что сосуды, несмотря на нанесенную травму и внесение индуктора ангиогенеза (шовный материал), в роговицу не врастали. Помимо антиангиогенной активности пептиды оказывали противоотечный эффект. Наиболее выраженными противоотёчными свойствами обладал фрагмент PEDF: площадь помутнения роговицы в соответствующем опытном глазу не превышала 10%, в то время как аналогичный показатель для фрагмента тумстатина составил 42%, а эндостатина – 82%. На второй модели ожога роговицы кролика был продемонстрирован клинически значимый дозозависимый аваскулогенный эффект фрагмента тумстатина (69-95). Предположена гипотеза, что взаимодействие данного пептида с интегринами на поверхности ЭК может приводить к нарушению контактов этих клеток с базальной мембраной и последующему апоптозу ЭК.
В целом для подавления патологического ангиогенеза предлагается комплексный подход с применением на ранних стадиях PEDF и тумстатин, а на поздних – эндостатин и тумстатин. Эндостатин и тумстатин, наряду с антиангиогенным эффектом обладает способностью подавлять пролиферацию опухолевых клеток.
2 Создана гибридная конструкция, в состав которой помимо гена фактора роста эндотелия сосудов человека VEGF165 входили ген тиоредоксина и последовательность, кодирующая сайт для расщепления протеазой вируса гравировки табака (TEV протеазой). В качестве штамма-носителя использовали клетки E.coli C3030 (NEB), содержащие в своем геноме ген дисульфидизомеразы. Уровень биосинтеза гибридной конструкции достигал 40% от общего клеточного белка, при этом более 90% ГБ было получено в биологически активной димерной форме. ГБ очищали с помощью ионообменной хроматографии на колонке Q Sepharose HP (GE Healthcare) и расщепляли TEV протеазой (выход реакции составил 40%).
Разработка способов посттрансляционной модификации рекомбинантных полипептидов с помощью химико-ферментативных методов
Лаборатория биотехнологии
Разработан метод получения рекомбинантного тимозина бета 4 – представляющего собой 43-членный полипептид, N-концевая аминокислота которого ацетилирована. Тимозин β4 проходит клинические испытания в качестве препарата для лечения трофических язв, ран и ожогов роговицы, а также острого инфаркта миокарда. В данной работе мы предлагаем способ получения рекомбинантного предшественника тимозина β4 и его последующего направленного химического ацетилирования. Дезацетилтимозин β4 получали в составе гибридного белка с тиоредоксином и специфическим сайтом для расщепления протеазой вируса гравировки табака (TEV протеазой). Была разработана следующая схема выделения дезацетилтимозина β4: (i) биосинтез растворимого гибридного белка (ГБ) в Escherichia coli; (ii) очистка ГБ с помощью ионообменной хроматографии; (iii) расщепление ГБ TEV протеазой; (iv) очистка дезацетилтимозина β4 от тиоредоксина с помощью ультрафильтрации. Аминоконцевое ацетилирование полученного пептида осуществляли добавлением уксусного ангидрида к раствору дезацетилтимозина β4 при pH 3,0. Выход реакции составил 55%. Дальнейшую очистку тимозина β4 производили с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработанный нами способ выделения рекомбинантного тимозина β4 является перспективным для масштабирования и позволяет получать высокоочищенный препарат для медицинского применения с выходом 20 мг с 1 л культуры
Получены синтетические гены трех аналогов гирудина (гирудин-1, [Leu1, Thr2]гирудин-1 и [Leu1, Thr2]гирудин-1/3), которые были клонированы в экспрессионный вектор pTwin1 в одной рамке считывания с геном мини-интеина DnaB из Synechocystis sp. Штаммы-продуценты соответствующих гибридных белков были созданы на основе штамма E.coli ER2566. Разработаны схемы получения 63-десульфатогирудина-1 и его аналогов, включающие стадии выделения гибридного белка после разрушения клеточной биомассы штаммов-продуцентов, ренатурацию целевого пептида в составе гибридного белка, его рН-индуцируемое расщепление и хроматографическую очистку целевого продукта. Получены конъюгаты аналогов гирудина с альдегидами полиэтиленгликоля (5 кДа) и полисиаловой кислоты (14 кДа). С помощью стандартного амидолитического теста были определены антитромботические активности полученных пептидов.
Получение ферментов, важных для жизнедеятельности микобактерий , вызывающих туберкулез с целью изучения их пространственной структуры и механизма работы активного центра
Лаборатория биотехнологии
Рекомбинантный микобактериальный фермент Фосфопантетеин аденилилтрансфераза Mycobacterium tuberculosis (РРАТ Mt) получен в клетках E. сoli с использованием сконструированного бактериального штамма-продуцента. Биомассу содержащую целевой фермент суспендировали в лизирующем буфере, подвергали дезинтеграции ультразвуком и центрифугировали. Супернатант, фракционировали на колонке с Sepharose Q XL в градиенте NaCl. Контроль фракций проводили спектрофотометрически при 280нм и с помощью SDS-PAGE в 15% геле. Фракции, содержащие РРАТ, объединяли и фракционировали на Sepharose Q HP в градиенте NaCl. Фракции, содержащие РРАТ объединяли, концентрировали ульрафильтрацией и отделяли минорные количества белковых и небелковых примесей с помощью гель-фильтрации на Sepharose S-200. Полученный фермент концентрировали до концентрации 17,3мг/мл и хранили при -70 С.
Кристаллы фермента выращены методом встречной диффузии в капиллярах в условиях невесомости в оборудовании японского космического агентства JAXA, в экспериментальном модуле Kibo [1]. От выращенных кристаллов на синхротроне SРring8 собраны дифракционные наборы до разрешения 1.6Å (свободный РРАТ Mt) и 1.5 Å (комплексы РРАТ Mt/СоА, PPAT Mt/ДФСоА).
С использованием полученных наборов методом молекулярного замещения решены структуры PPAT Mt в апо-форме и в комплексах с лигандами. Структуры уточнены при разрешении 1.69, 1.59 и 1.59 Å, Rf составили 0.1704, 0.1611 и 0.1627, Rfree – 0.2195, 0.2108 и 0.2115 соответственно для апо-формы, комплекса с СоА и комплекса с ДФСоА. В полученных структурах определены места связывания лигандов, охарактеризовано их окружение, прослежены конформационные изменения, сопровождающие связывание лигандов.
Разработка технологии изучения безопасности продуктов, полученных биотехнологическими методами
Лаборатория биологических испытаний
Изучено влияние экзогенного белка теплового шока 70 кДа на развитие грамположительного сепсиса у крыс. Показано, что белок теплового шока 70 кДа способен уменьшать токсические эффекты липотейхоевой кислоты, которая является структурным компонентом клеточной стенки Staphilococcus aureus. Внутривенное введение липотейхоевой кислоты вызывает гибель до 50% животных, белок теплового шока 70 кДа снижал гибель животных до 10%.
Получение и молекулярно-генетический анализ модифицированных растений для современной биотехнологии
Лаборатория биотехнологии растений
С целью повышения биобезопасности трансгенных растений разработан способ получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген HBsAg. Проведен молекулярно-биологический и биохимический анализ растений поколений F0 и F1. Показан стабильный синтез HBs-антигена в безмаркерных растениях табака и томата поколения F1. На лабораторных мышах проведены испытания иммуногенности клубней безмаркерного картофеля, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В. Показано значительное повышение уровня антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных животных, сохраняющееся в течение более года после начала иммунизации. До настоящего времени не существовало данных о мониторинге иммунитета к вирусу гепатита В такой продолжительности при использовании трансгенных растений в качестве съедобной вакцины. Получены трансгенные растения, экспрессирующие ген HBsAg под контролем модифицированного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35S с четырьмя энхансерами. Количество HBs-антигена достигало 0,1% от общего растворимого белка растений, что достаточно для исследования иммуногенности.
Получены трансгенные растения табака с суперэкспрессией гена антимикробного пептида цекропина Р1 (сесР1). Для трансформации использовали полученную конструкцию бинарного вектора pPCV91::сесР1. Экспрессия клонированного гена осуществлялась под контролем конститутивного суперпромотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S), содержащего 4 энхансерных последовательности CaMV 35S и нетранслируемую ΔΩ лидерную последовательность тРНК вируса табачной мозаики. Проведена агробактериальная трансформация растений табака. Полученные трансгенные растения проявляли повышенную устойчивость к фитопатогенным бактериям Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae и грибам Sclerotinia sclerotiorum, Phomopsis helianthi.
Получены колонизированные растения томата, картофеля, земляники и табака с повышенной устойчивостью к фитопатогенам ( Erwinia carotovora, Sclerotinia sclerotiorum) и ксенобиотикам (нафталин, паракват). Для микробной колонизации использовали полезные ассоциативные штаммы Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas putida и Methylovorus mays.
Изменения в репродуктивной сфере у трансгенных растений табака с модифицированной экспрессией гена hmg1 продемонстрированы с применением биохимических и микроскопических методов, а также с помощью сочетания методов ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени. Показано снижение генеративных функций у «антисмысловых» линий растений, что выявлено как в развитии мужской и женской репродуктивной сферы, так и при формировании семени. Обнаружено ингибирование уровня экспрессии гена hmg1 в пыльниках этих линий. Методами микроскопии и мезоструктурного анализа показано изменение толщины листа и плотности упаковки клеток у трансгенных линий, выявлена корреляция между анатомией листа «смысловых» форм трансгенных растений и их устойчивостью к Pseudomonas syringae. Ингибирование экспрессии гена hmg1 снижало устойчивость «антисмысловых» линий растений табака к действию тяжелых металлов. Детальное исследование содержания стеринов в листьях трансгенных растений продолжено с помощью метода газовой хроматографии. Проведена агробактериальная трансформация растений томата и картофеля генетическими конструкциями с геном hmg1.
Полевые испытания и вопросы биобезопасности трансгенных растений
Станция искусственного климата «Биотрон»
Закладка опытного участка для изучения вертикального переноса гетерологичного генетического материала в насаждениях многолетних древесных культур на экспериментально сертифицированном МВГКИД полигоне для испытаний трансгенных растений начата в 2010 году. Однако экстремальные погодные условия лета 2010 года привели к гибели значительной части насаждений и задержке развития уцелевших, что потребовало перезакладку значительной части насаждений.
Весной 2011 года были высажены трансгенные растения сливы сорта Стартовая экспрессирующие гены GFP и GUS. В частности содержащих кассету экспрессии pNov35SGFP 9 линий по 3 растения; pBin35SmGFP5-ER 1 линия, 3 растения; pGAGFP-AFVY 4 линии по 3 растения; pCam35SGFP 7 линий по 3 растения и 3 линии трансформированные конструкцией pCamPPVRNAi содержащей в качестве репортерного гена GUS. В качестве доноров высажены нетрансгенные растения сливы того же сорта на расстояниях 3, 5. 10, 25, 50, 100 и 150 м для оценки частоты переноса трансгенной пыльцы, перекрестного опыления и образования гибридного потомства. Высажено 10 саженцев трансгенной яблони, в том числе 4 растения содержащих репортерный ген gfp и 6 растений четырех линий, содержащих репортерный ген gus. Также высажены контрольные нетрансгенные саженцы яблони на расстоянии 3, 10, 50, 100 и 150 м для проведения анализа переноса генов с пыльцой от трансгенных деревьев к нетрансгенным.
Разработка методов и получение растений с/х культур, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам и с улучшенным качеством урожая
Станция искусственного климата «Биотрон»
Для проведения экспериментов по генетической трансформации хозяйственно-ценного генотипа томата ЯЛФ использовали вектор pBI35SAgNHX2, содержащий ген вакуолярного Na+/H+ антипортера agnhx, клонированного из генома растения-галофита Atriplex gmelina, а также содержащий ген-селективный маркер nptII.
В результате субкультивирования инокулированных агробактериальной суспензией эксплантов семядолей на питательной среде для индукции органогенеза побегов с добавлением селективного агента (канамицин, 25 мг/л) было отобрано 13 независимых канамицин-устойчивых каллусных тканей, из которых впоследствии регенерировали полноценные зеленые побеги, успешно пролиферирующие и укореняющиеся в присутствии летальных доз канамицина (100 мг/л)
Для подтверждения интеграции целевого и маркерного генов в геном томата был проведен ПЦР-анализ. При амплификации с использованием специфических праймеров на последовательность гена nptII были получены фрагменты, соответствующие позитивному контролю (плазмидной ДНК) во всех случаях, тогда как интеграция гена agnhx обнаружилась только у семи из тринадцати канамицин-устойчивых линий. Препараты тотальной геномной ДНК также проанализировали на отсутствие бактериального гена virB с целью исключения ложноположительных результатов вследствие бактериальной контаминации. Эффективность трансформации, рассчитанная как отношение полученных трансгенных побегов к общему числу эксплантов, линии ЯЛФ томата с использованием бинарного вектора pBI35SAgNHX2 составила соответственно 10,0% (по селективному гену) и 5,4% (по целевому гену).
Получение растительной системы синтеза рекомбинантных белков (биофарминг)
Станция искусственного климата «Биотрон»
В результате проведённых исследований получены трансгенные растения табака и ряски малой, экспрессирующие пептид М2е вируса гриппа птиц H5N1 Curgan2005 в трансляционном слиянии с белками β-глюкуронидазой и субъединицей Б рицина. Методом ИФА был проведен количественный анализ уровня накопления целевых протеинов в трансгенных растениях, экспрессия слитого белка М2е- β-глюкуронидаза в растениях табака находилось в диапазоне 0,005-0,2% общего растворимого белка, М2е- субъединица Б рицина- 0,1-0,3%. Уровень экспрессии этих белков в ряске малой был существенно выше, экспрессия слитых белков М2е- β-глюкуронидаза и М2е- субъединица Б рицина находилась в диапазоне 0,4-2,6% и 0,2-1,2% общего растворимого белка, соответственно. В результате отобраны линии трансгенных растений ряски, экспрессирующих слитые белки М2е- β-глюкуронидаза на уровне 2,6% и М2е- субъединица Б рицина- 1.2% общего растворимого белка, соответственно. В настоящее время проводится тестирование биомассы полученных растений-продуцентов на лабораторных животных.
Изучение молекулярных механизмов секреторного процесса внеклеточных бактериолитических ферментов грамотрицательной бактерии Lysobacter sp. XL1
Лаборатория нейрохимии ФИБХ
Грамотрицательная бактерия Lysobacter sp. XL1 является продуцентом внеклеточных литических ферментов, разрушающих компоненты клеточной стенки других бактерий и простейших эукариот. Установлены их антагонистические свойства в отношении болезнетворных микроорганизмов грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов, дрожжей, оомицетов, что предполагает использование в медицинской и ветеринарной практике в качестве альтернативы антибиотикам. Задача создания высокоэффективных штаммов-продуцентов литических ферментов делает необходимым исследование их механизмов секреции. Секретируемые бактерией сериновые эндопептидазы - AlpA и AlpB, на 59% гомологичные друг другу, первоначально синтезируются в виде белков-предшественников, содержащих сигнальный пептид, N-концевой пропептид и зрелую часть, превращающуюся в активную форму в процессе созревания и секреции ферментов. Для иммунохимического исследования процессинга и секреции ферментов AlpA и AlpB были получены и охарактеризованы представительные панели моноклональных антител против пропептидов эндопептидаз AlpA и AlpB. Задача получения моноклональных антител значительно осложнялась высокой степенью гомологии между исследуемыми антигенами. Так из 12 полученных моноклональных антител против пропептида эндопептидазы ALpA, только 2 (ProA 1 и ProA-2) не обладали иммуноперекрестной реактивностью с нативной формой пропептида AlpB. Однако при этом все 12 полученных моноклональных антител против пропептида AlpB не взаимодействовали с нативной формой пропептида AlpA. Проведена иммунохимическая характеристика моноклональных антител, не обладающих перекрестной иммунореактивностью: изотипирование, константы аффинности. Для антител ProA-1 и ProA-2 константа, характеризующая их взаимодействие с нативной формой пропептида AlpA, составляла 3.5х109М-1 и 2.9х109М 1,соответственно. Значения констант аффинности моноклональных антител против пропептида AlpB варьировали от 1,5х108М-1 до 2.2х109М-1. Показано также отсутствие перекрестной иммунореактивности с денатурированными формами исследуемых антигенов для антител против пропептида эндопептидазы AlpB и для антител ProA-1 и ProA-2 Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности полученных моноклональных антител и их пригодности в качестве инструментов исследования для изучения белок-белковых взаимодействий и механизмов секреции этих эндопептидаз. С помощью полученных моноклональных антител против ProB был идентифицирован AlpB-белковый комплекс и оптимизированы условия его стабилизации химическими кросс-сшивающими реагентами в клетках Lysobacter sp. XL1, секретирующих исследуемые ферменты. Исследована кинетика образования AlpB-белковых комплексов а, следовательно, и уровня секреции фермента в зависимости от времени культивирования Lysobacter sp. XL1.