Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?астворов происходит медленное изменение конформации ЛФ и накопление таких мономеров, которые легко образуют его высокоолигомерные формы.
При помощи измерения светорассеяния на угол 900 была исследована кинетика олигомеризации ЛФ после добавления буфера, соли и лигандов (см. рис. 8).
Рис. 8. Относительное изменение светорассеяния на угол 90о при инкубации ЛФ в 50 мМ трис-НСl буфере от отсутствии (а) и в присутствии 0.1 М KCl (б). Реакционные смеси инкубировали в отсутствие других лигандов (кривые 1), в присутствии 50 мМ АТР (кривые 2) или 5 мМ олигосахарида (кривые 3).
Как видно из рис. 8а, в отсутствие КСl, происходит сильное увеличение СР раствора ЛФ в течение первых примерно 10 ч инкубации, а затем ее заметное уменьшение. При добавлении в инкубационную смесь АТР или олигосахарида процесс олигомеризации ЛФ замедляется; максимальные изменения СР наблюдаются после примерно 4-5 ч инкубации, а затем идет медленное возрастание СР.
Добавление 0,1 М КСl скорость начального процесса олигомеризации уменьшается, но после длительной инкубации достигается кажущегося плато значений СР, близкое к таковому для смеси без соли. Добавление АТР или олигосахарида в инкубационную смесь, содержащую 0,1 М КСl, приводит в большей степени к замедлению олигомеризации ЛФ в присутствии олигосахарида, чем АТР. Интересно, что как в отсутствие, так и в присутствии КСl после 100 ч инкубации раствора ЛФ с АТР значение СР выше, чем для растворов без АТ. Наклон кинетических кривых изменения интенсивности СР в присутствии АТР и олигосахарида свидетельствует в пользу того, инкубация смесей более 100 ч (~ 4 дней) может приводить к образованию большего количества олигомерных форм ЛФ в присутствии лигандов, чем в их отсутствии. Учитывая это, в описанных ниже экспериментах анализ содержания олигомерных форм ЛФ проводили после инкубации всех реакционных смесей более 10 дней.
3.1Анализ олигомерных форм ЛФ методом гель-хроматографии
Как отмечалось выше, ЛФ взаимодействует со многими широко распространенными сорбентами, используемыми для гель-хроматографии. Сотрудниками ЛФР ИХБФМ в результате анализа ряда сорбентов было показано, что наиболее оптимальным для анализа ЛФ c помощью метода гель-хроматографии является Sepharose 4B. Этот сорбент слабо взаимодействует с ЛФ и относительное время выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии соответствует их относительным молекулярным массам. Учитывая это, в данной работе был проведен анализ относительного содержания олигомерных форм ЛФ, инкубированного в различных условиях, с помощью гель-хроматографии.
Для оценки относительной массы олигомерных форм ЛФ сначала была проведена гель-хроматография контрольных белков с известной мол. массой и построена калибровочная кривая (рис. 9).
Рис. 9. Калибровочная кривая для оценки мол. масс белков, полученная с использованием белков с известными мол. массами: ЧСА (67), IgG (150 кДа), IgA (400 кДа), IgM (800 кДа).
Следует отметить, что точное определение мол. масс небольших пиков белка около 800 кДа и более сильно затруднено, так как при таком малом времени выхода, значительными становятся такие факторы как ширина пика, а так же объем и время нанесения пробы на сорбент. Кроме того, Sepharose 4B обладает плохой эффективностью разделения белков с мол. массами ? 800 кДа. Учитывая это, далее следует считать, что фракции ЛФ, кажущиеся мол. массы которых оценены приблизительно как 780, 800 кДа и более (но не меньше) могут иметь и значительно большую мол. массу, или быть смесью нескольких субфракций белка, мол. масса которых превышает 780 кДа. В то же время пик декамера, соответствующий 754 кДа (см. ниже), скорее всего, можно считать определенным с более высокой точностью ввиду его малой ширины и хорошей высоты пика белка, а так же существенного удаления от характерного места выхода небольших по размеру пиков более 780 кДа.
На рис. 10 приведен профиль оптической плотности, соответствующей гель-хроматографии лактоферрина, инкубированного в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, а так же после инкубации ЛФ в этом же буфере, содержащем, 0,1 и 0,15 КСl. Видно, что ЛФ, инкубированному в буфере без соли, соответствует большой пик с кажущейся мол. массой 275 кДа с двумя плечами в области 295 и 251 кДа. Кроме того, видны пики в области ?145 кДа и относительно маленький по величине пик в области примерно 780 кДа.
Добавление к раствору ЛФ 0,1 М КСl ведет к очень сильному уменьшению пика с мол. массой 275 кДа и резкому увеличению пиков с мол. массами 145 и 68 кДа. Одновременно происходит уменьшение высокомолекулярного пика в области 780 кДа. Увеличение концентрации КСl до 0,15 М приводит к еще более сильному перераспределению относительного количества ЛФ в указанных пиках. После инкубации ЛФ с 1 М КСl обнаружен только один пик белка, элюируемый в области 68 кДа.
Рис. 10. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5 в отсутствие других лигандов (синяя кривая), в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая) или 0,15 M КСl (зеленая кривая).
При интерпретации полученных данных (рис. 10) следует принять во внимание следующие данные. Добавление КСl в инкубационную смесь, а также буфер, с помощью которого уравновешена колонка, должно приводить не только к диссоциации олигомерных форм ЛФ, но и уменьшению их взаимодействий с сорбентом. Кроме того, кажущиеся мол. масс