Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
ы белков при гель-хроматографии не всегда полностью соответствуют их истинным мол. массам, поскольку время выхода белков при гель-хроматографии зависит не только от мол. массы, но и от геометрической формы белковых глобул и их олигомеров. С учетом мол. массы мономера (76 -80 кДа), молекулярные массы олигомерных форм белка должны быть равными: быть 152 - 160 кДа (димер), 228-240 кДа (тример), 304-320 кДа (тетрамер). Если учесть, что мономер с мол. массой 76 -80 кДа демонстрирует кажущуюся мол. массу примерно 68-70 кДа, то приблизительные мол. массы олигомеров могут быть близкими: 136 -140 кДа (димер), 204 - 210 кДа (тример), 272 - 280 кДа (тетрамер). Реально наблюдаемые значения мол. масс димера (145 кДа ) и тетрамера (295-275 кДа) несколько ниже, чем вычисленные из значения истинной мол. массы мономера ЛФ, но в то же время немного больше, чем оцененные из значения кажущейся мол. массы мономера, найденной при гель-хроматографии. Особенно интересно, что пик при 275 кДа имеет два плеча при 295 и 251 кДа. По месту положения два из трех плохо разделенных пика могут соответствовать только тетрамерной форме ЛФ, в то время как третий пик с кажущейся мол. массой порядка 220 кДа может быть белковым тримером. Разделение тетрамерной формы белка на два пика может быть связано как с различной эффективностью взаимодействия различных тетрамерных форм ЛФ с сорбентом, так и возможностью различного типа укладки мономеров ЛФ при образовании тетрамера.
Как видно из рис. 11, согласно данным гель-хроматографии после инкубации ЛФ с олигосахаридом, белок в основном присутствует в растворе в виде мономера, димер проявляется в виде слабо выраженного плеча (150 кДа), небольшое количество ЛФ выходит в зоне тетрамера. Интересно, что добавление 0,15 М соли к раствору, содержащему олигосахарид, ведет к количественной димеризации белка, но уменьшению количества тетрамера.
В отсутствие соли, АТР лучше чем олигосахарид стимулирует образование димерной и тетрамерной форм ЛФ (рис. 12). Кроме того, становится заметным образование олигомера с мол. массой более 780 кДа. В то же время, в нейтральном буфере в присутствии АТР образование тетрамера происходит в существенно меньшей степени, чем в его отсутствии (рис. 10 и рис. 12). Добавление 0,1 М КСl приводит к замедлению процессов образования димера и тетрамера ЛФ. В то же время происходит явное увеличение доли крупного олигомера с массой более 780 кДа.
Рис. 11. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с олигосахаридом в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,15 M КСl (зеленая кривая).
Рис. 12. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с 50 мМ АТР в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая)
Рис. 13. Анализ олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии. Приведены профили оптического поглощения при 280 нМ (А280) препаратов ЛФ, инкубированных в разных условиях. Перед гель-хроматографией ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, с 50 мМ АМР в отсутствие (синяя кривая) и в присутствии 0,1 M КСl (сиреневая кривая) или 0,15 M КСl (зеленая кривая).
Особенно необычным оказалось поведение ЛФ в присутствии 50 мМ АМР. До добавления соли распределение различных форм ЛФ было сопоставимо с таковым для АТР, за исключением наличия декамерной (754 кДа) формы. Добавление 0,1 М KCl привело к резкому увеличению димерной формы ЛФ, практически полному исчезновению декамера, и исчезновению крупного олигомера с кажущейся мол. массой более 800 кДа (рис. 13). При этом, на профиле хроматографии появилась новая олигомерная форма ЛФ с мол. массой 359 кДа, соответствующая пентамеру. Повышение концентрации КСl до 0,15 М привело к разрушению пентамера и тетрамера и небольшому перераспределению ЛФ между димером и мономером.
С использованием данных гель-хроматографии были оценены массовые доли каждого из олигомеров, образующихся после инкубации ЛФ в различных условиях (табл. 5).
Таблица 5 Относительное содержание различных олигомерных форм ЛФ, образующихся при его инкубации в различных условиях, оцененное из данных гель-хроматографии.
Условия образованияОлигомерная форма* мер**Декамер**МономерДимерТетрамерПентамерДекамерБуфер + 1 M NaCl100000000Буфер без соли37,51,760,8001,84,7Буфер +0,1 M KCl4,893,71,5002,05,2Буфер +0,15 M KCl4,095,50,58000,20,6Буфер (Б) + AMP***69,023,47,100,610,526,9Б + AMP + 0,1M KCl29,061,31,68,106,617,0Б +AMP + 0,15M KCl30,068,91,0004,210,8ATP60,136,83,0007,920,1Б +ATP + 0,1 M KCl76,121,12,8008,622,0Б+ATP + 0,15 M KCl39,058,92,2004,411,1Б+Олигосахарид93,45,41,2006,416,3Б +Oc + 0,1 M K Cl16,682,70,7001,53,9Б +Oc +0,15 M KCl12,687,40,030000*Приведены усредненные данные трех независимых экспериментов, ошибка определения приведенных значений не превышала 10-15 %.** Содержание декамера и 16-мера рассчитано теоретически на основании данных СР (см. ниже). ***Б - буфер.
На основании данных Таблицы 5 можно выделить несколько закономерностей:
) Инкубация ЛФ в буфере, не содержащем КСl и других соединений основной формой белка является тетрамер.
) Добавление в раствор ЛФ 0,1 - 0.15 М КСl ведет к разрушению тетрамеров с образованием преимущественно димеров белка.
) В отсутствие соли ATP, АМР и олигосахарид стимулируют образование в основном мономерной формы белка, и в меньшей степени его димера. Добавление соли в присутствии этих лигандов стимулирует образование ди?/p>