Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?вание высокоолигомерных форм ЛФ, которые, по-видимому, не стабильны и разрушаются в процессе гель-хроматографии на Sepharose.
ЛФ - конформационно активный белок, который может по-разному изменять свою структуру в присутствии лигандов разного типа. Поэтому различная эффективность образования олигомеров различной степени олигомеризации и стабильности, обнаруженные с помощью данных СР и гель-хроматографии (табл. 5) может свидетельствовать в пользу того, что под действием разных лигандов и в их отсутствии образуются олигомеры с разным типом организации. В пользу того, что олигосахарид, АТР и АМР стимулируют образование олигомеров ЛФ разного типа свидетельствуют данные о различной стабильности белковых ассоциатов, образующихся в присутствии этих лигандов. Так согласно данным СР, олигомерные формы ЛФ, образованные в присутствии АТР, разрушаются до мономеров в присутствии 50 мМ MgCl2 в течение 25 мин. в то время как АМР-зависимые комплексы в этих условиях достаточно стабильны (данные не приводятся).
С помощью индикатрис светорассеяния можно так же оценить средний радиус инерции для набора частиц, содержащихся в каждом из растворов. рис. 14 приведены данные по СР растворами ЛФ, инкубированными в различных условиях. С помощью уравнения Гинье средний радиус инерции (Rg) для ЛФ, инкубированного с ATP в присутствии 0,1 M KCl составил 41 3 нм, а для ЛФ инкубированного с AMP в 0,1 M KCl - 40 3 нм. Эти величины существенно больше величины Rg = 26.7 , найденного с помощью МУРР для мономера ЛФ. Поскольку основной вклад в СР вносят крупные по размеру частицы, то эти значения Rg можно считать нижней оценкой размеров крупных олигомеров.
3.3Анализ олигомеров ЛФ методом абляции
Одним из современных методов исследования мол. масс белков является МАЛДИ. Однако, этот метод исследования является достаточно жестким и при переходе нанесенных на носитель белков в газовую фазу происходит частичное разрушение белковых молекул. В связи с этим метод МАЛДИ не пригоден для исследования белковых олигомерных комплексов, в которых субъединицы обычно связаны слабыми нековалентными электростатическими, гидрофобными, Ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями и водородными связями. Метод абляции различных соединений с твердых подложек существенно мягче, чем МАЛДИ, по условиям переведения соединений в газовую фазу. В настоящее время сотрудниками ИЦиГ и ИКХиГ СО РАН показано, что пероксидаза хрена может быть аблирована из лиофилизованного состояния и при этом она сохраняет свою каталитическую активность.
В данной работе впервые были сделаны попытки проанализировать на примере комплексов ЛФ возможность анализа олигомерного состояния белков с помощью метода абляции. Сначала были проведены эксперименты по абляции некоторых стандартных белков из лиофилизованного состояния. В качестве подложки для лиофилизации использовали силуфольные пластины. Растворы белков наносили на поверхность пластин, содержащих слой силикагеля и на обратную - чистую сторону алюминиевой пластины. Образцы, нанесенные на пластины, замораживали над жидким азотом и затем подвергали абляции. Было показано, что абляция белков с поверхности, содержащей силикагель, приводит к появлению в спектре в основном частиц с мол. массой, соответствующей использованным белкам. В то же время использованные белки в этом случае подвергались частичной деструкции. В то же время при абляции белков с алюминиевой поверхности заметной деструкции белков не наблюдалось. Аналогичные данные были получены при абляции комплексов ЛФ с силуфольной и алюминиевой поверхности. На рис. 16 приведен спектр белковых частиц, соответствующий комплексу ЛФ после его инкубации в нейтральном буфере в отсутствии соли.
Основной формой ЛФ в случае силуфола (рис. 16а) является тетрамер; димер и мономер не разделились. Наличие частиц в спектре частиц с размером менее 5 нм позволяет предположить, что произошло разрушение не только олигомеров крупнее тетрамера, но так же и разрушение мономера.
При абляции ЛФ с алюминиевой подложки (рис. 16б) и при меньшей интенсивности излучения, мономер и димер не были обнаружены, но удалось зарегистрировать крупные олигомеры с размером порядка 103 нм, что согласуется данными светорассеяния. При условии что еще более крупные олигомеры не "развалились", это может означать, что растворы ЛФ могут содержать ассоциаты типа 16-меров (или больше). Таким образом очевидно, что абляция с алюминиевой подложки более перспективна для исследования нековалентных олигомерных комплексов белков.
Рис. 16. Абляция ЛФ инкубированного в буфере. а) ЛФ аблироавнный с силуфола, б) ЛФ аблированный с алюминиевой подложки.
В то же время нельзя исключить, что лиофилизация на алюминиевой подложке может вести к стабилизации высокоолигомерных комплексов ЛФ, что ведет к исчезновению комплексов меньшего размера, обнаруженных при абляции ЛФ с силуфола и методом гель-хроматографии. В то же время, обнаружение частиц с размером меньше 5 нм при абляции с силуфола может свидетельствовать в пользу разрушения высокоолигомерных комплексов ЛФ при их взаимодествии с силуфолом
3.4Обсуждение результатов
В данной работе было проведено исследование олигомерных форм ЛФ с помощью четырех различных методов. Согласно литературным данным, ЛФ существует в виде двух основных олигомерных форм - мономера и тетрамера. С помощью метода гель-хроматографии в данной работе впервые показано, что в нейтральном ?/p>