Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
±уфере в отсутствии соли основной формой белка, устойчивой в условиях хроматографии на Sepharose, действительно является тетрамер, который эффективно диссоциирует до димеров и мономеров после добавления КСl (рис. 10). Нами также впервые показано, что что по данным гель-хроматографии природные лиганды ЛФ (олигосахарид, АТР и АМР) в отсутствие соли понижают степень олигомеризации ЛФ, стимулируя образование преимущественно димерной (АТР и АМР) или мономерной (олигосахарид) формы белка (рис. 11-13), одновременно (по данным СР) повышая сренеквадратичную массу (рис. 14) за счет образования крупных ассоциатов - декамера и предположительно 16 мера..
Интересно, что добавление КСl по-разному влияет на лиганд-зависимую олигомеризацию ЛФ. Олигосахарид в присутствии соли стимулирует образование димера (рис. 11), ATP разрушает тетрамерную и димерную форму ЛФ, и единственный повышает долю крупного олигомера (рис. 12), а в присутствии АМР происходит формирование димера и пентамера (рис. 13). Однако, это все касается форм ЛФ, в той или иной степени устойчивых в условиях гель-хроматографии. Следует полагать, что высокоолигомерные формы ЛФ, которые обнаружены в растворах белка с помощью СР, скорее всего, не устойчивы в условиях гель-хроматографии и разрушаются либо при контакте с сорбентом в самом начале хроматографического процесса, либо в процессе гель-хроматографии. В пользу такого разрушения может указывать наличие "длинного размазанного хвоста" у пика с мол. массой 754 кДа (рис. 13), соответствующего ЛФ, инкубированному с АМР в отсутствие соли. Данные по гель-хроматографии в целом плохо согласуются с данными СР, всегда показывая меньшую олигомеризацию.
Методом СР были обнаружены крупные олигомеры и оценены их радиусы инерции (рис. 14). Согласно этим данным в растворе ЛФ присутствует в гораздо более высокоолигомерном состоянии, чем следует из данных по гель-хроматографии. Согласно данным СP (рис. 15) все лиганды: олигосахарид < АТР < АМР, в отсутствие KCl стимулируют образование олигомерных форм ЛФ. При этом добавление KCl ведет к примерно одинаковому уменьшению степени олигомеризации ЛФ в буфере содержащем и не содержащем олигосахарид. В то же время, АТР-зависимая степень олигомеризации в присутствии 0,1 М КСl даже несколько больше, чем в отсутствии соли и слабо понижается при повышении концентрации соли до 0,15 М (рис. 16). Максимальный уровень олигомеризации, наблюдаемый в присутствии АМР, постепенно понижается после добавления 0,1 М КСl, а затем 0,15 М соли. Однако, он остается высоким и сопоставимым с таковым для ЛФ в отсутствие соли и других лигандов, даже при добавлении 0,15 М КСl (рис. 15). Это свидетельствует о том, что олигомерные формы ЛФ, существующие в растворе, не стабильны и разрушаются при контакте с Sepharose 4В в процессе гель-хроматографии.
Данные по оценке олигомерных форм с помощью абляции лиофилизованных препаратов ЛФ с алюминиевой подложки также могут свидетельствовать в пользу наличия в растворе высокоолигомерных форм ЛФ по размеру соответствующих как минимум 16-меру. В целом, данные СР и абляции приводят к сопоставимым результатам, подтверждающим наличие крупных олигомеров.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Методом гель-хроматографии впервые проведен анализ олигомерных форм лактоферрина (ЛФ), которые образуются под действием его природных лигандов. Показано, что в нейтральном буфере при низкой ионной силе основной формой лактоферрина, устойчивой в условиях хроматографии, является тетрамер, диссоциирующий до димеров и мономеров после добавления 0,1 М КСl. АТР и АМР в отсутствие соли стимулируют образование преимущественно димерной, а олигосахарид - мономерной формы белка. Олигосахарид в присутствии соли КСl стимулирует образование димера, ATP разрушает тетрамерную и димерную форму ЛФ, а в присутствии АМР происходит формирование димера и необычной формы лактоферрина - пентамера.
2. Методом светорассеяния исследована эффективность образования олигомеров в присутствии и отсутствии различных лигандов и показано, что лактоферрин в присутствии АТР и АМР образует высокоолигомерные формы. Согласно средним радиусам инерции этих олигомеров они могут содержать в своем составе до 10 и более мономеров ЛФ.
. Впервые исследованы олигомерные формы лактоферрина методом лазерной абляции. Данные светорассеяния и абляции приводят к сопоставимым результатам, подтверждающим наличие в растворах лактоферрина крупных по размеру олигомеров лактоферрина. Сравнение данных гель-хроматографии, светорассеяния и лазерной абляции свидетельствует в пользу того, что высокоолигомерные формы лактоферрина могут разрушаются при их контакте с сорбентом в процессе хроматографии.
Список литературы
лактоферрин дифракция олигомерный аббеляция
Birgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331., H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331., P.F., Viljoen, M. Lactoferrin: a general review. (1995) Haematologica., 80(3), 252-267.
Отт В.Д., Дюкарева С.В., Мельников О.Р. Лактоферрин и перспективы его использования в алиментарной профилактике анемий. (1993) Вопр. Питания, 1, 6-13., E.D. Human lactoferrin: a novel therapeutic with broad spectrum potential. (2001) J. Pharm. Pharmacol. 53(10), 1303-10.
. Metz-Boutigue, M.H., Jolles, J., Mazurier, J., Schoentgen, F, Legrand, D., Spik, G., Montreuil, J., and Jolles, P. Human lactotransferrin: amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins. (1984) Eur. J. Biochem., 145, 659., G.B., Anderson, B.F., Norris, G.E., Thomas, D.H., Baker, E.N. Structure of human apolactoferrin at 2.0 A r