Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
uot; Венгрия), маркеры молекулярной массы белков ("Sigma", США), другие реактивы - препараты отечественного производства квалификации ос.ч.
Препараты IgG, sIgA и IgM антител были любезно предоставлены сотрудниками ЛФР ИХБФМ СО РАН. Электрофоретически гомогенные препараты ЛФ из молока лактирующих женщин были получены Бабиной С. Е. (ИХБФМ СО РАН) согласно методикам описанным ранее [27, 28, 29].
2.2.2Подготовка образцов лактоферрина для анализа
После получения электрофоретически гомогенных препаратов лактоферрина их диализовали против 50 мМ Трис-НСl, рН 7.5, замораживали в жидком азоте и лиофилизовали на стандартной установке для лиофилизации при температуре - 3-4оС. Лиофилизованные препараты хранились практически без потери активности примерно в течение 1 года. В проведенных нами исследованиях использовались свежеполученные растворы лиофилизованных препаратов ЛФ (2 - 10 мг/мл) в 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5. Сразу после растворения препаратов ЛФ их подвергали центрифугированию (5 мин, 10 тысяч оборотов/ мин) на центрифуге Eppendorf для удаления небольшого количества нерастворимого белка. Затем полученные растворы ЛФ (2-10 мг/мл ) инкубировали в 50 мМ Трис-НСl буфере, рН 7,5, без дополнительных компонентов или добавляли КСl (0,1 - 1 M), а также один из природных лигандов в насыщающих концентрациях: 50 мМ АТР, 50 мМ АМР или 5 мМ мальтогептозу. В зависимости от типа эксперимента смеси инкубировали при 25С в течение 5 ч или нескольких суток (вплоть до 1 месяца) при 25 или 4 С. Аликвоты реакционных смесей использовали для анализа олигомерного состояния ЛФ с помощью четырех различных методов (см. ниже) сразу после их получения или после инкубации в течении различного времени.
2.2.3Условия проведения гель-хроматографии белков
Для анализа олигомерного состояния ЛФ после его инкубации в различных условиях использовали сорбент Sepharose 4B, который из всех проверенных смол для гель-хроматографии обладал минимальной способностью взаимодействавоть с ЛФ и его олигомерными комплексами. Хроматографию проводили с помощью хроматографа "Biocad Sprint", снабженного перестальтическим насосом с мягкой подачей раствора на колонку. Раствор ЛФ (0,2- 0,4 мл; 2-4 мг /мл) в в 50 мМ Трис-НСl буфере, рН 7,5, содержащем или несодержащем другие лиганды (до и после инкубации в различных условиях, см. выше) наносили на колонку Sepharose 4B (0,8 х 33 см), предварительно уравновешенную этим же буфером. Элюцию белков с сорбента проводили с помощью 50 мМ Трис-НСl буфера, рН 7,5, без соли или буфер содержал 0,1 или 0,15 М КСl. За выходом ЛФ следили по его поглощению на 280 нм. Для оценки мол. масс ЛФ и его комплексов с помощью метода гель-хроматографии использовали белки с известной мол. массой. Была получена калибровочная кривая, которая приведена ниже. Контрольные белки, как и ЛФ, наносили в объеме 0,1 - 0,3 мл в концентрации 1-3 мг/мл. Чувствительность детектора хроматографа равна 110-8 г/мл. Среднеквадратичное отклонение пиков при хроматографии препаратов ЛФ было найдено <2%. Минимальная характерная селективность разделения ближайших пиков ЛФ составила 1,3-1,4. Степень разделения варьировала от 0,3 до 2,5. Точность соответствия стандартам была оценена ? 6%.
2.2.4Условия проведения экспериментов по анализу ЛФ методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР)
Смеси (0.1 - 2 мл) для анализа содержали 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, 1-6 мг/мл (12-72 мкМ) ЛФ, в некоторые из них добавляли 0.1 - 1 М КСl. К реакционным смесям добавляли АМР, АТР или олигосахарид (0.1-5 мкл) в различных концентрациях, включая насыщающие: 50 мМ нуклеотиды и 5 мМ олигосахарид. В некоторых экспериментах в смесь были добавлены 3 M NaCl или 3 M MgC12 до конечной концентрации 1 М или 5 -25 мМ, соответственно. В МУРР и СР экспериментах использовали те же смеси, что и для гель-хроматографии. Измерения с помощью МУРР и СР и обработку полученных результатов проводили как описано выше.
2.2.5Измерение индикатрис светорассеяния
Прибор для измерения светорассеяния от анализируемых образцов (световой дифрактометр) состоял из одного фотодетектора и 14 лазерных монохроматических источников, установленных по внутреннему периметру камеры светорассеяния. В центр камеры помещали образец, а управление установкой и получение значений интенсивности производили при помощи компьютера. При этом поочередно включались лазерные источники и рассеянное излучение попадало в фотоприемник (детектор), после чего сигнал с приемника поступал на фотоэлектронный умножитель, откуда через аналоговый цифровой преобразователь передавался на компьютер. Индикатрисы светорассеяния измеряли в угловом диапазоне 2? = 56,25 123,750 (h = 0.0018 0.004 А-1), где h = 4 • ? • n ? sin(?)/?; n - показатель преломления буферной смеси (~1,35). Длина волны используемого светового излучения ? = 4300 А, применима к исследованию частиц 0,005 - 50 мкм, температура образцов при измерении индикатрис 200С. В индикатрисы вносили поправки на фоновое рассеяние и поглощение излучения образцом. Измерения проводились с точностью 3-5%, исходя из оценки точности , где N количество измерений. Чувствительность прибора составляет 10 импульсов/сек.
Калибровку прибора проводили для контроля влияния факторов, влияющих на точность измерений эффектов светорассеяния (состояние чистоты кюветы, аппаратные искажения и помехи). Для этого регулярно измерялись индикатрисы рассеяния (зависимости интенсивности рассеяния от угла) для стандартного образца (полистерин, диаметр частиц 2R = 0,2 мкм). Известно, что радиус инерции (Rg) и радиус (R) для однородной сферы связаны, как