Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
? центре белка происходит фиксация аниона, в физиологических условиях это карбонат или бикарбонат ион, который с помощью электростатических взаимодействий связан с остатком аргинина. Присутствие аниона необходимо для прочного связывания железа с ЛФ, так как он нейтрализует положительный заряд катиона металла [3].
Сродство ЛФ к железу (Кd ~ 10-24 M) в ~300 раз выше, чем сродство трансферрина []. Кроме того, показано, что в слабокислой среде сродство ЛФ к железу повышается, что и облегчает переход металла с трансферрина на ЛФ при воспалительных процессах, когда рН тканей снижается за счет накопления молочной и других кислот []. Степень насыщения железом нативного ЛФ в женском молоке составляет по оценкам разных авторов от 10 до 30% [13, 14].
1.1.3Олигомерные формы лактоферрина
Как в плазме крови, так и в секреторных жидкостях ЛФ может существовать в виде различных олимерных форм от мономера, до тетрамера. Показано [14], что белок обнаруживает резко выраженную тенденцию к полимеризации in vitro и in vivo, и при высоких концентрациях преобладают олигомерные формы ЛФ. Кроме того, с помощью метода гель-хроматографии рядом авторов было обнаружено, что доминирующей формой ЛФ в физиологических условиях является тетрамер [, , ]; соотношение мономер: тетрамер при концентрации белка 10-5 М составляет 1 : 4. Авторы работ [15, 16] также предположили, что олигомерное состояние ЛФ определяется концентрацией данного белка в среде. Кроме того, по их мнению, полимеризация ЛФ строго зависела от присутствия ионов Ca2+. В присутствии ионов кальция и при концентрации белка менее 10-10 - 10-11 M авторы наблюдали преобладание мономерной формы белка. При концентрациях ЛФ более 10-9 - 10-10 M происходил переход в тетрамерную форму. Интересно отметить, что титр ЛФ в крови соответствует величине именно этой "переходной концентрации", и, таким образом, ЛФ в крови должен быть представлен как в виде мономера, так и тетрамера. Причем авторы не принимали во внимание существование прочих (димерных и тримерных) форм белка. Эти же исследователи обнаружили, что ряд функциональных свойств ЛФ определяется его олигомерным состоянием. Так, ЛФ в виде мономера способен к прочному связыванию с ДНК и регуляции процессов гранулопоэза, а тетрамерная форма не связывает ДНК [15, 16].
Авторами работы [] при определении олигомерного состояния ЛФ методом гель-хроматографии обнаружена только мономерная форма белка при нанесении на колонку 1 мг белка и около 10 % тетрамерной формы при нанесении 4 мг ЛФ. Причем тетрамер присутствовал только при анализе железонасыщенной фракции белка. Кроме того, SDS-электрофорез в восстанавливающих условиях показал, что только 30 % тетрамерной формы переходит в мономер, что, по их мнению, говорит о ковалентных межмолекулярных связях, формирующихся в процессе полимеризации. Тем не менее, природа межсубъединичных связей олигомера ЛФ до настоящего времени не выяснена, а ковалентных связей между мономерами ЛФ не обнаружено.
Следует отметить, что в рассмотренных выше (и ниже) работах для анализа олигомерного состояния ЛФ авторы использовали метод гель-хроматографии и различные сорбенты полисахаридной природы. Интересно, что ЛФ эффективно взаимодействует с такими носителями и эффективность взаимодействия различных олигимерных форм может существенно зависеть как от их олигомерного состояния, так и конформации различных форм ЛФ [19]. В следствие этого, место выхода олигомерных форм ЛФ при гель-хроматографии может не соответствовать их истинным мол. массам. Так, например, в работе [] было показано, что в отсутствии соли в высокой концентрации (1 М) ЛФ может "залипать" на таких носителях как Sephadex и элюироваться с колонки за времена, соответствующие высокоолигомерному состоянию. Добавление АТР к ЛФ привело к смещению пика белка при гель-хроматографии в место выхода между мономерной и димерной формами белка [19]. Было сделано предположение, что взаимодействие ЛФ с АТР приводит к диссоциации его олигомерных форм. Однако, как будет показано ниже, ЛФ связывается не только с АТР, но и различными полисахаридами, включая сорбенты, используемые при гель-хроматографии. Поэтому нельзя исключать, что обнаруженный эффект АТР может быть связан с уменьшением сродства ЛФ к полисахаридным матрицам под действием АТР, что приводит к уменьшению времени выхода ЛФ с сорбента и ошибочным заключениям об его олигомерном состоянии.
Кроме того, большинство исследователей не принимают во внимание олигомерную организацию белка, рассматривая его a priori как мономер с молекулярной массой 76 кДа. Есть все основания полагать, что в организации олигомерного состояния белка участвуют слабые нековалентные взаимодействия - преимущественно гидрофобные и электростатические контакты боковых групп остатков аминокислот молекулы ЛФ и, возможно, гликозидных остатков белка.
1.1.4Взаимодействие лактоферрина с лигандами и его изоформы
Одним из фундаментальных свойств ЛФ является его способность связывать полианионы типа гепарина, ДНК и РНК. Показано, что взаимодействие ЛФ с гепарином и другими полианионами имеет электростатическую природу []. Ф. Фурманским и соавторами [] было установлено, что связывание белка с ДНК может иметь специфический характер, они обнаружили три специфические последовательности ДНК, к которым белок проявляет повышенное сродство: GGCACTT(G/A)C, TAGA(A/G)GATCAAA и ACTACAGTCTACA.
Недавние исследования показали, что в случае специфических последовательностей ДНК, ЛФ обладает двумя сайтами связывания []. Один из ?/p>