Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?их является высокоаффинным (Kd = 8.010-9 М), второй сайт связывает ДНК с гораздо меньшим сродством (Kd ~ 1.010-3 М). Показано, что высокоаффинный сайт локализован в N-концевой части молекулы белка, аналогично полианион-связывающему сайту ЛФ и антибактериальному домену. Взаимодействие ЛФ с гепарином и тРНК ингибировало связывание ДНК с белком. Это свидетельствует о том, что ДНК-связывающий сайт совпадает или частично перекрывается с полианион-связывающим сайтом и антибактериальным доменом ЛФ [22].
В работах [19, , ] было показано, что ЛФ взаимодействует с АТР и другими нуклеотидами. С помощью метода аффинной модификации было установлено, что АТР связывающий центр ЛФ локализован в С-концевой части белковой молекулы [19].
Ф. Фурманским и соавторами [, ] было показано, что ЛФ как гранулоцитов, так и молока человека представлен тремя изоформами, которые проявляют различное сродство к сорбенту Blue Sepharose и могут быть эффективно разделены с помощью этого сорбента. Причем только одна из изоформ (ЛФ-a), в отличие от двух других, способна связывать ионы железа. Все три изоформы белка проявляют сходные физические, химические и антигенные характеристики (молекулярная масса, изоэлектрическая точка, устойчивость к протеолитическому расщеплению). Однако оказалось, что две изоформы, не связывающие ионы железа (ЛФ-? и ЛФ-?), обладают РНК-гидролизующей активностью.
В ряде работ [, , ] хроматография ЛФ на Blue Sepharose была использована для анализа возможности наличия у белка каталитически активных изоформ белка с другими каталитическими активностями. При хроматографии ЛФ на Blue Sepharose достигнуто разделение белка на несколько отдельных субфракций с разным сродством к сорбенту, в результате которого происходит отделение от основного пика белка нескольких дополнительных пиков ЛФ. Все пики белка были исследованы в реакции расщепления ряда различных субстратов и показано, что кроме гидролиза РНК различные изоформы ЛФ активны а гидролизе ДНК (ДНКазаная), АТР (АТРазная), олиго- и полисахаридов (амилолитическая), а также отщеплении 5-концевого фосфотной группы олигонуклеотидов (5-фосфатазная активность). Положение пиков различных активностей на профиле хроматографии в основном не совпадало, но некоторые пики ЛФ обладали несколькими ферментативными активностями. Субстратная специфичность ЛФ в гидролизе ДНК отличается от таковой для известных ДНКаз человека [28]. В отличие от основной фракции ЛФ с самым высоким сродством к Blue Sepharose, все субфракции ЛФ с ДНКазной активностью оказались цитотоксичными и подавляли рост клеток раковых линий мышей и человека.
Возможные причины различия свойств этих изоформ пока не установлены. Авторы работ [27-29] предположили, что наличие изоформ может быть обусловлено различной степенью гликозилирования белка и/или его фосфорилирования. Тем не менее, эта гипотеза пока не проверена экспериментально.
Как следует из рассмотренных выше данных, в организме человека могут присутствовать изобелковые формы ЛФ [25-29]. Принимая во внимание эти данные, а также возможность существования ЛФ в как минимум четырех различных олигомерных состояниях (мономер - тетрамер) очевидно, что образование различных олигомерных форм белка, состоящих из субъединиц, соответствующих различным избелковым формам, является одним их потенциальных путей модификации свойств лактоферрина.
Дополнительным путем регуляции-изменения биологических свойств ЛФ может быть его взаимодействие с большим числом биологически активных молекул: РНК, ДНК, АТР, белками или лигандами полисахаридной природы.
Молекула ЛФ обладает исключительной конформационной лабильностью и может существовать в самых разных конформационных состояних. Это связано с тем, что в молекуле белка два домена соединены с помощью достаточно гибкого аминокислотного фрагмента. Это создает дополнительные возможности различного рода изменений конформации белка в отсутствии и в присутствии природных лигандов и, как следствие, самым разным изменениям его биологических свойств. Таким образом, следует полагать, что в регуляции свойств ЛФ человека может быть задействовано несколько совершенно различных механизмов, которые включают: а) аллостерическое изменение конформации белка под действием ионов железа и других металлов, а также нуклеиновых кислот, белков, нуклеотидов или полисахаридов, б) изменение олигомерного состояния белка под действием указанных природных лигандов, в) существование мономеров белка в виде большого числа различных изобелковых форм, а также образования олигомерных форм белка, состоящих из различных субъединиц, соответствующих этим формам.
Таким образом, очевидно, что несмотря на более, чем 50-летнюю историю исследования механизмов функционирования ЛФ, изучение этого белка представляется исключительно актуальным и в настоящее время. Современные достижения в области развития новых физико-химических методов исследования белков представляются исключительно перспективными для анализа закономерностей возможности олигомеризации ЛФ под действием различных лигандов.
2.Экспериментальная часть
2.1Теоретические основы использованных методов и аппаратурное обеспечение
2.1.1Методы рентгеновской и оптической дифракции
2.1.1.1Рассеяние плоской волны веществом
Пусть плоская монохроматическая волна A0exp(ik0r) падает на рассеивающий центр О, который под действием излучения становится источником сферической волны (рис. 2). Тогд?/p>