Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
строения и физиологической роли было посвящено значительное число исследований, которые показали, что ЛФ содержится в плазме крови, нейтрофильных лейкоцитах и является одним из основных белков практически всех экзокринных секретов млекопитающих []. В наибольшей концентрации ЛФ содержится в молозиве человека (до 6 - 7 мг/мл), в процессе лактации этот показатель в молоке уменьшается до 1 мг/мл (Табл. 1) [].
Таблица 1. Уровень ЛФ в различных жидкостях и тканях человека в норме*.
Жидкости и тканиКонцентрация ЛФМолозиво5 - 7 мг/млПромежуточное молоко3 - 4 мг/млМатеринское молоко1 - 3 мг/млОколоплодная жидкость2 - 32 мкг/млДецидуальная оболочка матки9 - 95 мкг/г белкаАмнион2 - 37 мкг/г белкаХорион2 - 26 мкг/г белкаТрофобласт5 - 35 мкг/г белкаПуповина<1 мкг/г белкаБронхиальная слизь35 мкг/млСлезная жидкость2 - 3 мг/млСлюна4 - 20 мкг/млВагинальная слизь4 - 200 мкг/мг белкаСеменная жидкость0,1 - 0.2 мг/млСиновиальная жидкость35 - 46 мкг/млСпинномозговая жидкость10 - 12 мкг/мл**Кровь0,1 - 1,6 мкг/млВенозная плазма0,12 мкг/млКапиллярная плазма0,1 мкг/млПлазма при сепсисе200 мкг/млЭмбриональная сыворотка0,05 мкг/млПлазма новорожденного0,27 мкг/млНейтрофилы крови взрослого человека1,2 - 15 мкг/106 нейтрофиловНейтрофилы крови новорожденного12 - 30 мкг/107 нейтрофилов*Концентрация белка в некоторых жидкостях, таких как амнион, слюна, синовиальная жидкость в случае инфекции увеличивается в 2-10 раз [].
**при бактериальных менингитах, в нормальном состоянии ЛФ не детектируется
ЛФ представляет собой гликопротеид с мол. массой 76 000 - 80 000 дальтон [1-3]. Белок существует в двух формах - железонасыщенной (холо-ЛФ, 80 кДа) и железоненасыщенной (апо-ЛФ, 75 - 76,4 кДа). По аминокислотному составу и мол. массе он сходен с трансферрином (73,8 - 86 и 75 - 76,6 кДа холо- и апо -формы, соответственно). Аминокислотные составы ЛФ и трансферрина имеют 59% и 49% гомологии между двумя соответствующими доменами, входящими в состав этих белков []. Вторичные и третичные структуры этих двух белков также сходны между собой. ЛФ отличается от трансферрина антигенной структурой, углеводными компонентами, изоэлектрической точкой, растворимостью в воде и расположением железосвязыващих участков и сайтов гликозилирования этих белков.
ЛФ образован одной полипептидной цепью, которая содержит 703 аминокислотных остатка. На основании данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.0 была предложена модель трехмерной структуры ЛФ, согласно которой полипептидная цепь свернута в два гомологичных домена, называемых N- и C-долями, содержащими 1-338 и 339-703 остатки соответственно, а их концы соединены короткой a-спиралью (рис. 1). Каждая доля белка состоит из двух доменов: N1, N2 и C1, C2. Третичные структуры железонасыщенного и железоненасыщенного ЛФ различны; для апо-ЛФ характерна "открытая" конформация N-доли и "закрытая" конформация С-доли, а для Fe-ЛФ характерна закрытая конформация обеих долей (рис. 1) []. Между N- и C-долями наблюдается значительная степень гомологии: они имеют 125 одинаковых аминокислотных остатков, что составляет 37% гомологии [5].
Это привело к возникновению теории о копировании генов, когда 500 миллионов лет назад первоначальная молекула массой 40 кДа удвоилась и сформировала два гомологичных домена с молекулярной массой около 80 кДа [3]. Предполагают также, что ЛФ возник в процессе эволюции позже трансферрина.
Рис. 1. Структура апо-лактоферрина (железоненасыщенная форма) и Fe-ЛФ (железонасыщенная форма). Красным цветом показан сайт связывания полианионов - гепарина, липополисахаридов и хондриотинсульфата.
Углеводный компонент молекулы белка состоит из остатков сиаловой кислоты, фукозы, гексозы и N-ацетилглюкозоамина, которые образуют связи с остатками аспарагина 137 и 478 белковой части ЛФ []. ЛФ содержит два сайта гликозилирования по одному на N2 и C2 доменах, но степень гликозилирования белка может быть различной []. Именно поэтому мол. масса белка варьирует в диапазоне 76-80 кДа. Показано, что первичная структура гликозидных остатков ЛФ плазмы крови идентична углеводному компоненту ЛФ молока, за исключением двух остатков сахаров, связанных с белком N-гликозидной связью. Функция этих углеводных остатков точно не определена, однако их удаление не влияет на такие функции ЛФ, как связывание рецепторов [3]. ЛФ демонстрирует поразительную устойчивость к действию трипсина и трипсин - подобных протеаз, что обеспечивает сохранение целостности молекул белка в желудке. Было показано, что устойчивость ЛФ к деградации протеазами и при низких значениях рН обусловлена высокой степенью гликозилирования белка [3, ]. Железонасыщенная форма ЛФ более устойчива к протеолизу, чем апо-форма белка [3]. ЛФ относится к щелочным белкам, значение его изоэлектрической точки составляет 8,7 [].
1.1.2Связывание ионов железа
Каждая молекула белка может обратимо связывать два иона трехвалентного железа или ионы цинка, меди, магния и других металлов [3]. Причем центры связывания в каждой из двух белковых глобул, входящих в молекулу ЛФ, локализованы ближе к междоменной щели. В этих центрах железо координационно связано с двумя остатками тирозина, одним гистидином и одним остатком аспарагиновой кислоты []. Показано, что ЛФ участвует не только в транспорте ионов железа, цинка и меди, но и в регуляции их всасывания []. Наличие непрочно связанных ионов цинка и меди не влияет на железосвязывающую функцию ЛФ, а фактически даже усиливает ее. ЛФ образует с железом комплекс красноватого цвета. Одновременно с фиксацией ионов металла в железосвязывающе?/p>