Анализ комплексов лактоферрина молока человека
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?ерной формы ЛФ и уменьшение тетрамерной формы белка.
) В отсутствие соли только АМР стимулирует заметное образование декамера, а в присутствии 0,1 М КСl происходит образование необычной формы ЛФ, его пентамера.
Следует отметить, что пик белка, соответствующий олигомеру(ам) крупнее декамера (с мол. массой ? 780 -800 кДа) присутствовал в ряде реакционных смесей. Однако в случае анализа олигомерных форм ЛФ с помощью гель-хроматографии он был маленьким во всех случаях кроме АTР и 0,1 М KCl. Учитывая это, во всех случаях содержание этого пика было принято близким к 0. Скорее всего, этот олигомер является неустойчивым и разрушается во время хроматографии.
Следует отметить, что все олигомеры ЛФ являются не очень стабильными и легко разрушаются при добавлении соли. Кроме того, нельзя было исключить, что часть олигомерных форм ЛФ может разрушаться при гель-хроматографии, а взаимодействие молекул ЛФ с сорбентом может стимулировать диссоциацию комплексов белка. Поскольку некоторые пики, соответствующие высокоолигомерным формам, относительно маленькие, а их уменьшение может быть связано с перераспределением белковой плотности между пиками представляется в процессе хроматографии, корректная оценка содержания с помощью гель-хроматографии высокоолигомерных форм белка в растворе представляется не возможной. Одним из методов оценки относительных размеров белков непосредственно в растворе является метод СР. Как указывалось выше, олигомеры ЛФ, содержащие от 1 до 4 мономерных единиц белка, должны относительно слабо рассеивать свет. В то же время, именно олигомерные формы, содержащие больше 4 субъединиц белка, должны вносить максимальный вклад в СР.
3.2Анализ олигомеров ЛФ методом светорассеяния
В экспериментах по СР были использованы те же самые растворы ЛФ, что и для гель-хроматографии. Для каждого раствора были измерены индикатрисы СР (рис. 14). Экстраполируя индикатрисы СР к нулевому углу и пользуясь тем, что I(0)~N*M2, можно оценить среднеквадратичную молекулярную массу в каждой из смесей (рис. 15).
Рис. 14. Анализ светорассеяния олигомерными формами ЛФ, полученными в разных условиях. ЛФ инкубировали в 50 мM Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 0,1 М КСl (кривая 1) и один из лигандов: 2 - 5 мМ олигосахарид, 3 - 50 мМ АТР, 4 - 50 мМ АМР.
Рис. 15. Значения корней среднеквадратичных масс для всех исследованных растворов ЛФ. Серии из трех столбиков диаграммы соответствуют: 1 - олигосахарид, 2 - ЛФ в отсутствии лигандов, 3 - АТР, 4 - АМР. В каждой из серий столбики соответствуют: 1 - ЛФ в отсутствие соли, 2 - в присутствии 0,1 M КСl, 3 - в присутствии 0,15 M КСl.
При получении данной оценки считалось, что ЛФ, инкубированный с олигосахаридом в 0,15 M KCl, имеет среднеквадратичную массу 145 кДа (согласно данным гель-хроматографии) и не содержит олигомерных форм большего тетрамера.
Оцененная таким образом среднеквадратичная масса олигомерных форм ЛФ оказалась во всех случаях больше массы, оцененной с помощью гель-хроматографии, а в некоторых случаях она была больше массы тетрамера. Это означает, что долю крупных олигомерных форм, не учтенных при гель-хроматографии (или диссоциировавших в ходе хроматографии), можно оценить с помощью СР.
Очевидно, что при ассоциации могут образовываться различные олигомерные формы ЛФ, содержащие более 4-х мономерных единиц, которые будут рассеивать свет. По данным гель-хроматографии АМР стимулирует достоверное образование декамера, который в присутствии соли диссоциирует до пентамера. По приблизительным оценкам олигомеры с кажущейся мол. массой больше 800 кДа, которые наблюдаются в ряде случаев, могут быть примерно 16-мерами. К сожалению, оценка относительного содержания ассоциатов с разной степенью олигомеризации на основании полученных данных не представляется возможной. В то же время, можно оценить примерное содержание какого-либо одного высокоолигомерного ассоциата, если предположить, что данный ассоциат - единственный крупный олигомер (декамер и больше). На основании численных данных, приведенных на рис. 15, был проведен теоретический анализ возможного содержания 10-мерного и 16-мерного ассоциатов ЛФ в анализируемых растворах белка. Полученные данные приведены в табл. 5.
Интересно, что согласно проведенному анализу данных СР декамер может присутствовать во всех смесях ЛФ, кроме белка инкубированного в буфере, содержащем 1 М КСl. В данной модели анализ теоретического содержания крупных олигомеров проводился путем сравнения с наименее олигомеризованной смесью - ЛФ с олигосахаридом в 0,15 М КСl, т.е. считалось что в данном растворе олигомерный состав соответствует гель-хроматографии). При этом содержание декамера эффективнее всего стимулируется и регистрируется хроматографически только при добавлении АМР, затем (игнорируя содержание более крупных форм даже и зарегистрированных гель-хроматографией) АТР и хуже всего олигосахарида. Добавление 0,1 М КСl приводит к уменьшению содержания в растворе высокоассоциированных форм ЛФ, кроме ЛФ инкубированного с АTP, в котором олигомеризация повышается (согласно гель-хроматографии за счет крупного олигомера, при разрушении тетрамера).
В случае предположения о содержании в растворе только 16-мера ЛФ численные значения уменьшаются примерно в 2-3 раза, но общие закономерности те же самые (Таблица 5).
Таким образом, данные СР свидетельствуют в пользу того, что в растворе, в отсутствие других лигандов, а также в присутствии АТР и АМР может происходить образ?/p>